الليزر التقاط تسليخ مجهري - تظاهرة لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية ومنطقة بطني السقيفية بكل

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا العصبية الدوبامين من أقسام الأنسجة على الشرائح. يتم تحقيق ذلك عن طريق التقسيم الأول لأنسجة الدماغ الدماغي البطني المجمد إما على شرائح منمقة أو شرائح غشاء القلم. بعد ذلك ، يتم تصنيف الخلايا العصبية الدوبامين بالكيمياء المناعية الفلورية السريعة.

ثم يتم تجفيف الأنسجة وتحميلها في مجهر الالتقاط بالليزر. ثم يتم إرفاق الخلايا العصبية الدوبامين المسماة بغطاء المضاعف المشترك الأصغر باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء ويتم عزل الحمض النووي الريبي أو الجزيء المهم. أظهرت النتائج أنه يمكن الحصول على الحمض النووي الريبي بكمية ونوعية كافية لقياسات PCR الكمية باستخدام الفحص المجهري بالليزر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل التشريح الإجمالي أو اللكمات الدقيقة ، هي أن مجموعات الخلايا الفردية يمكن أن تكون معزولة أو مناطق دماغية منفصلة للغاية. للتحضير لتراجع عزل الحمض النووي الريبي ، تنزلق شرائح تحضير السيلين أو ميثيل البولي إيثيلين أو زجاج غشاء القلم في محلول إزالة التلوث واستخدم الماء الخالي من الحمض النووي الريبي لغسلها ثلاث مرات باستخدام سلسلة متدرجة من الإيثانول الخالي من الحمض النووي الريبي ، وتجفيف الشرائح وتجفيفها بالمكنسة الكهربائية لمدة 30 دقيقة باستخدام أقسام الأنسجة المقطوعة بسمك 10 ميكرون وتركيبها على الحمض النووي الريبي المحضر. تحافظ الشرائح المجانية على العينات المجمدة أثناء التقسيم للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي.

بعد ذلك لإجراء الكيمياء المناعية. استخدم قلما مسعورا لتحديد الخطوط العريضة للأنسجة والسماح لها بالجفاف ثم في محلول ميثانول الأسيتون الفردي. ثبت الأنسجة عند سالب 20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد إزالة المنديل من الفريزر ، قم بتغطية الأقسام ب 100 إلى 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة للتيروزين هيدروكسيلاز NPBS و 1٪ تريتون لمدة 10 دقائق.

ثم استخدم PBS مع 1٪ tritton لشطف الشرائح قبل تغطية الأقسام ب 100 إلى 200 ميكرولتر من IgG المضاد للأرانب الماعز ، المسمى ب Alexa Fluor 4 88 ، احتضان لمدة خمس دقائق ثم استخدم PBS لشطف الشرائح مرتين. بعد ذلك ، قم بتجفيف العينات المتكاملة من الإيثانول الخالي من الحمض النووي الريبي لمدة 30 ثانية لكل منها كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. احتضن في الزيلين لمدة دقيقة وثانية ، واغسلها لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة الشرائح مباشرة قبل استخدامها مع المضاعف المشترك الأصغر واتركها تجف في الهواء. بعد تحميل أغطية المضاعف المشترك الأصغر والشرائح وإعداد نظام المضاعف المشترك الأصغر وفقا لبروتوكول النص ، اضبط ووجه التقاط ليزر الأشعة تحت الحمراء للقوة. ضع الغطاء في منطقة من الشريحة بعيدا عن الأنسجة الموجودة على شريط أدوات ليزر الالتقاط.

حدد تمكين ، واضبط نبضة الطاقة وعدد ضربات الليزر. أطلق ليزر الأشعة تحت الحمراء عندما يكون الغطاء فوق جزء من الشريحة بدون أنسجة ، وتحقق لمعرفة ما إذا كان الليزر يذوب بشكل كاف غشاء غطاء المضاعف المشترك الأصغر بعد ضبط شدة ليزر الأشعة تحت الحمراء ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد التقاط الليزر هنا لتوجيه الليزر لأداء المضاعف المشترك الأصغر على الخلايا العصبية الدوبامين الفردية من شرائح الإعداد الكلاين.

ابدأ بالانتقال إلى المنطقة ذات الاهتمام لالتقاط الخلايا لالتقاط الخلايا الفردية من جانب الإعداد الرأسي. في شريط أدوات التشريح المصغر، حدد علامة التبويب المضاعف المشترك الأصغر (LCM)، ثم أيقونة النقطة الواحدة. بعد ذلك في شريط أدوات المجهر، استخدم علامة تبويب الغالق للتبديل بين التألق والمجال الساطع باستخدام علامات تبويب مرشحات الفلورسنت لاختيار المرشحات المناسبة واستخدام علامات تبويب الأهداف لتغيير التكبير.

بمجرد أن تكون الخلايا ذات الأهمية مرئية في نافذة الفيديو المباشر ، اضبط الحجم الموضعي المستخدم لتمييز الخلايا ذات الأهمية بالحجم التقريبي للخلايا. حدد الخلايا ذات الأهمية عن طريق تحديد أيقونة النقطة الواحدة ثم النقر فوق الخلايا. بمجرد وضع علامة على الخلايا على شريط أدوات التشريح المجهري ، حدد علامة التبويب go cut and capture وسيطلق ليزر الأشعة تحت الحمراء تلقائيا على جميع الخلايا المحددة المحددة.

حرك الغطاء بعيدا عن القسم إلى منطقة مفتوحة من الشريحة للتحقق مما إذا كانت الخلايا قد تم التقاطها على غطاء المضاعف المشترك الأصغر (LCM). عند الانتهاء من جمع الأنسجة ، حرك الغطاء بالنقر بزر الماوس الأيمن على الغطاء وتحديد نقل إلى ثم تفريغ التحميل كما هو موضح في بروتوكول النص ، استخدم الشريحة التي تمت معالجتها للكيمياء المناعية كدليل لتحديد منطقة الاهتمام من الأنسجة الموجودة على غشاء القلم. في شريط أدوات التشريح الجزئي ، حدد علامة التبويب القص والالتقاط ، ثم حدد علامة تبويب خط القطع وباستخدام الشريحة المسماة الكيمياء النسيجية المناعية كدليل ، حدد منطقة الاهتمام ضمن الهدف 10 ×.

اختبر ليزر الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية وأطلق النار وتصويبه كما هو موضح سابقا. في هذا الفيديو ، في شريط أدوات التشريح الدقيق ، حدد علامة التبويب الالتقاط والقص. ثم حرك غطاء المضاعف المشترك الأصغر من الأنسجة لتحديد ما إذا كان قد تمت إزالة الأنسجة من القسم وتثبيتها على الغطاء.

عند الانتهاء من جمع الأنسجة لإزالة الغطاء ، انقر بزر الماوس الأيمن على الغطاء وحدد نقل ثم تفريغ الصور المجهرية في هذه الأشكال توضح أن LCM قادر على عزل الخلايا العصبية الدوبامين المناعية الفردية للتيروزين هيدروكسيلاز باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء أو ليزر الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية لأن الاستخدام الأكثر شيوعا للخلايا في الأنسجة المعزولة باستخدام المضاعف المشترك الأصغر هو تحليل الحمض النووي الريبي. تم تحسين الإجراءات المقدمة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي كما يتضح من انخفاض نسبي في ارتفاع ذروة RRNA 28 S مقارنة بذروة 18 S ، تم تقليل جودة الحمض النووي الريبي في عينات LCM ذات السلامة المنخفضة بعد الكيمياء المناعية ، متبوعا بتثبيت الأسيتون مقارنة بالحمض النووي الريبي للدماغ بالكامل. لقياس كمية الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من الخلايا العصبية المكتسبة عبر L-C-M-R-N-A من الخلايا العصبية الدوبامين من منطقة البط البري البطني خارج التحضير الملحي ، تم عزل الشرائح بناء على المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه ، تم عزل ما مجموعه 17.3 و 24.8 و 50.9 بيكوغرام لكل ميكرولتر من 5 و 100 و 200 خلية عصبية دوبامين على التوالي.

E باستخدام QPCR لقياس جودة الحمض النووي الريبي ، تم عكس مجموعة من تركيزات الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي في الدماغ بالكامل من الخلايا العصبية الدوبامين وتم قياس جين بيتا أكتين من هذه القياسات بتركيزات ثلاث نقاط 55 و 6 0.82 و 20 نقطة 58 بيكوغرام لكل ميكرولتر من 5 و 100 و 200 خلية عصبية دوبامين على التوالي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مجهر التقاط الليزر لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية أو لعزل مناطق الخلايا العصبية الدوبامين.