منظور تقني في الحديث شجرة الدائري البحث - كيفية التغلب على Dendroecological والخشب تشريحية التحديات

الهدف العام من التجربة التالية هو توليد خشب مكرر جيدا وعالي الحل. مجموعات بيانات تشريحية لدراسة آثار الوقت والعوامل البيئية على نمو الأشجار والشجيرات. يتم تحقيق ذلك باستخدام سائل غير نيوتوني لتثبيت الخلايا النباتية أثناء التقسيم الميكروتوم ، مما يسمح بتحليل مجهري مفصل للعينات كخطوة ثانية.

يتم تلطيخ المقاطع الدقيقة بشكل مزدوج لتسهيل التمايز بين الخلايا الخشنة وغير الخشبية ، ثم يتم التقاط صور رقمية للعينات. في نهاية المطاف ، يمكن إجراء تحليلات آلية قائمة على الخلايا لنمو النبات وتحليلات السلاسل الزمنية ذات الصلة للسماح بتقييم المعلمات التشريحية للخشب ذات الأهمية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل إرسال درجة العينة التي لا تمتلئ الخلايا بنشارة الخشب باستخدام تقنياتنا ، مما ينتج عنه عينات ذات جودة واضحة لتحليل الصور.

علاوة على ذلك ، فإن إضافة سائل غير نيوتن إلى الخلايا أثناء التقسيم يسمح بتجنب تقنية تضمين العينة في البارافين التي تستغرق وقتا طويلا. تم تطوير الميكروتومات الجديدة التي سنراها في الفيديو في مختبرنا ، ودمج لو نيتي المركزي في شانغ دوبس وزيورخ. تبرز بسبب الثبات العالي للتوجيه ، مما يسمح بقطع العينات الكبيرة والكثيفة.

لأخذ العينات الأساسية من سيقان الأشجار. ابدأ بوضع قلب زيادة حاد عموديا على المحور المتنامي لجذع الشجرة. بعد ذلك ، قم بتدوير النواة واستخدم مستخرج لإزالة العينة الأساسية الناتجة من الشجرة.

قم بتسمية النواة بمعرف محدد مميز بقلم رصاص ناعم على السطح الأساسي ، وكرر الإجراء على الجانب الآخر من الجذع عند جمع جميع العينات. قم بتخزين النوى الملصقة في حاوية مناسبة لحمايتها من التلف أثناء النقل. ثم بمجرد العودة إلى المختبر ، قم بتركيب اتجاه الألياف للعينات الأساسية ، في وضع مستقيم على عوارض دعم خشبية مع غراء خشب مقاوم للماء ، واتركها تجف لأخذ العينات الأساسية الدقيقة.

أولا ، استخدم إزميل لإزالة جزء من اللحاء حسب الضرورة. ثم ضع جهاز تثقيب خاص عموديا على المحور المتنامي على الجذع الذي أظهر للتو ، واستخدم مطرقة لاختراق نسيج الخشب من الجذع إلى حوالي سنتيمترين في العمق. أدر جهاز التثقيب لكسر النواة الدقيقة الناتجة داخل الأداة.

ثم قم بإزالة اللب من الجذع وتخزينه في أنبوب طرد مركزي صغير مسمى. لقطع سطح عادي على عينة أساسية ، ابدأ بتثبيت قلب الزيادة محل الاهتمام في الحامل الأساسي للميكروتوم الأساسي المطور حديثا لقطع الأسطح المستوية على النوى على مدى مدادها بالكامل. ثم ارفع اللب حتى يلامس الشفرة قليلا ، والتي يتم تثبيتها على توجيه محمل كروي فوق مدى النواة ، واسحب الشفرة لقطع الجزء الأول من الجزء العلوي من القلب.

بعد ذلك ، ادفع السكين خلف القلب. ارفع حامل العينة حوالي 10 ميكرون وكرر إجراء القطع حتى ما يقرب من ثلث اللب. يتم قطع القطر مما ينتج عنه سطح عادي مستمر.

لتحليل الصور التفصيلي للبنية التشريحية للعينات ، يجب تحضير الأقسام الدقيقة بنوع ميكروتوم آخر. أولا ، قم بإصلاح العينة الأساسية ذات الأهمية في حامل الميكروتوم للميكروتوم. ثم ضع الشفرة الدقيقة مسترشدة بتوجيه المحمل الكروي واسحب الشفرة فوق القلب.

ادفع الشفرة للخلف لرفع العينة بمقدار 20 إلى 30 ميكرون. ثم اسحب الشفرة فوق العينة. مرة أخرى ، كرر هذه العملية حتى يتم إنشاء سطح مستمر في الجزء العلوي من العينة.

الآن باستخدام فرشاة الطلاء ، قم بتغطية السطح الناتج بمحلول نشا الذرة. ثم ارفع العينة بمقدار 15 ميكرون وضع الفرشاة على سطح العينة. اسحب الشفرات ببطء نحو العينة ، وابدأ بقطع رفيع أسفل الفرشاة واستخدم الفرشاة لتوجيه القسم الموجود على سطح الشفرة عند قطع القسم بأكمله.

استخدم فرشاة أخرى وماء لإزالة الأنسجة من الشفرة ووضعها على شريحة زجاجية للسماح بالتمييز بين الهياكل الخشبية وغير الخشبية. اغسل الجلسرين بالماء باستخدام ماصة. بعد ذلك ، قم بتغطية الجزء الرطب ببضع قطرات من خليط من الزعفران والأزرق الفلكي.

بعد خمس دقائق ، اغسل الأصباغ بالماء ثم قم بتجفيف القسم على الفور بعلاجات الإيثانول المتتالية. بعد معالجة الإيثانول المجفف ، اشطف القسم بشكل متكرر بنسبة 100٪ xol. بمجرد أن يبقى xol واضحا.

قم بتغطية المنديل بقطرة بلسم كندا بنسبة 100٪ وغطاء زجاجي مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء. ثم ضع الشريحة الدقيقة الناتجة بين شريطين من البلاستيك المقاوم للحرارة وضعها على صفيحة معدنية. ضع وزنا أعلى الشريحة للحفاظ على القسم مسطحا ، ثم ضع الشريحة في فرن 60 درجة مئوية.

بعد 12 ساعة ، اترك الشريحة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة الوزن والشريط البلاستيكي. أخيرا ، قم بتنظيف الشريحة باستخدام شفرات الحلاقة لإزالة أي فائض بلسم باتباع إجراءات التقسيم والتلوين المقدمة قبل أن يتمكن المرء من تحضير جميع أنواع العينات بأحجام وأشكال مختلفة ، وأيضا باستخدام حوامل خاصة للدورة لإنشاء صور رقمية للأسطح الأساسية لتحليل السوعية. أولا ، قم بقص مستوى السطح الأساسي باستخدام الميكروتوم الأساسي كما هو موضح للتو ، واستخدم علامة لباد لتلطيخ السطح الناتج باللون الأسود.

بمجرد أن تجف الصبغة ، افركي السطح الأساسي بالطباشير الأبيض ثم اضغط على الطباشير في الخلايا بإصبع. قم بإزالة أي طباشير فائض ، ثم ضع اللب على مسرح مجهر مجهر مزود بكاميرا رقمية تبدأ من جانب واحد من القلب. احصل الآن على سلسلة من الصور المتداخلة قليلا حتى يتم التقاط السطح بالكامل.

ثم قم بتجميع الصور المفردة معا لإنشاء صورة كاملة للسطح الأساسي لإنشاء صور رقمية من الشرائح الصغيرة. ضع الشريحة على مرحلة المجهر واختر التكبير المناسب للهياكل المراد تحليلها. أخيرا ، احصل على صور متداخلة للأقسام المثبتة على الشرائح الدقيقة التي تم تنظيفها كما هو موضح للتو لعينة السطح الأساسية وقم بتجميع الصور معا لإنشاء صورة واحدة كاملة للقسم.

القدرة على امتلاك خلايا مفتوحة خطوة أولى مهمة نحو تكييف الهياكل البيئية التشريحية للدندرو في تحليل السلاسل الزمنية. للحصول على تحليل أكثر تفصيلا للقصبات الهوائية الخشبية المبكرة أو القصبات الخشبية المتأخرة في الصنوبريات ، هناك حاجة إلى أقسام دقيقة عالية الجودة هنا. يجب تجنب القطع الأثرية المحتملة مثل جدران الخلايا المكسورة.

إن تطبيق سائل غير نيوتوني على العينة ، مثل محلول نشا الذرة كما هو موضح للتو ، يدعم استقرار بنية الخلية. تتيح الأقسام الدقيقة تحديدا أكثر أمانا للرتب السنوية. هذا ينطبق بشكل خاص على الصنوبريات التي تنمو على حدودها الطبيعية.

كما هو موضح هنا ، فإن الحلقات الضيقة للغاية متكررة ولكن يصعب اكتشافها مجهريا. في الحالات القصوى ، تتكون الحلقات من صف أو صفين من الخلايا ، والتي قد تكون مرئية فقط عند استخدام الأقسام الدقيقة. عند تحليل الصور بتكبير عال ، تكون الخلايا المفردة مرئية.

يسمح برنامج التحليل شبه التلقائي بتحديد التغييرات في المعلمات الفردية مثل سمك جدار الخلية لجميع الحلقات المرئية داخل الصورة ، مما يشير إلى الحاجة إلى تحليل سلسلة زمنية ممتدة. يسمح التلوين المزدوج للأقسام الدقيقة بتصور مراحل التقشير المختلفة. يمكن بعد ذلك ربط هذه المعلومات بالبيانات البيئية لفترة الغطاء النباتي المعنية لتحديد علاقة نمو مناخي أكثر تفصيلا بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيئة DRO لاستكشاف المعلمات التشريحية المختلفة للأشجار والشجيرات. يقلل استخدام هذه الطريقة بشكل كبير من الوقت اللازم لإنتاج أقسام كبيرة وعالية الجودة. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل تحت غطاء الدخان وارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نسخ جيد وحل للغاية لوضع مجموعات البيانات التشريحية لدعم تحليل السلاسل الزمنية.