تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام خلايا الخميرة للعثور على العمليات البيولوجية التي تستهدفها مادة كيميائية ذات أهمية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحديد ملف استجابة الجرعة أولا لمادة كيميائية للخميرة. الخطوة الثانية هي زراعة مجموعة كاملة من سلالات جينات الخميرة بالضربة القاضية على جرعة مميتة من المواد الكيميائية وعلى لوحة تحكم.

بعد ذلك ، يتم تحديد طفرات الخميرة شديدة الحساسية للمادة الكيميائية. يتم تحليل هذه القائمة بالمعلومات الحيوية للكشف عن جميع الجينات اللازمة لتحمل المادة الكيميائية. الخطوة الأخيرة هي إجراء تكرار بيولوجي للتجربة بإنتاجية منخفضة.

هذا يتحقق من صحة أي تفاعلات جينية كيميائية تم العثور عليها. في النهاية ، يتم استخدام طريقة الفحص الجيني الكيميائي عالية الإنتاجية لإظهار المنتجات الجينية والمسارات البيولوجية المستخدمة لتحمل المادة الكيميائية ذات الأهمية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل النمو التنافسي للطفرات المشفرة في الاستزراع السائل هي عدم الحاجة إلى تقنيات البيولوجيا الجزيئية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الكيميائية ، مثل كيف يمكن لجزيء صغير جديد أن يثبط نمو الخلايا حقيقية النواة. للبدء ، قم بإعداد ثقافة الخميرة الليلية عن طريق الخروج بمقدار 4 7 4 1 خلية على صفيحة A-Y-E-P-D واحتضانها لمدة 48 ساعة عند 30 درجة مئوية أو حتى تتشكل مستعمرات مرئية. عندما تكون المستعمرات جاهزة.

قم بإعداد المزارع السائلة بين عشية وضحاها عن طريق قطف مستعمرة واحدة وتلقيح خمسة ملليلتر من وسائط YEPD السائلة في وعاء معقم. ثم احتضن طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع الدوران المستمر أو الرج. بعد ذلك ، قم بإعداد وسائط أجار صلبة تحتوي على جرعات مختلفة من المادة الكيميائية المراد اختبارها.

للقيام بذلك. أولا ، قم بإعداد العديد من محاليل المخزون من المادة الكيميائية ذات الأهمية بمعدل 100 ضعف التركيز النهائي في مذيب مناسب. ثم لكل تركيز يتم اختباره ، قم بتقسيم ثلاثة ملليلتر من أجار YEPD المنصهر في عدة أنابيب زراعة معقمة.

ضع الأنابيب التي تحتوي على الأجار في حمام مائي 55 درجة مئوية لمنع تصلب الأجار. الآن ، لكل تركيز من المواد الكيميائية ليتم اختباره عند 13 ، إطلاق أبيض لمركب 100 × إلى حصة من أجار تكس المنصهر ، الأنبوب لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان للخلط ثم ماصة مليلتر واحد من كل أنبوب في آبار مكررة في صفيحة عالمية 12 ، اسمح للوحة بالثبات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 10 ملليلتر من وسائط YEPD السائلة بميكرولترين من ثقافة الخميرة المشبعة طوال الليل.

ثم ماصة 25 ميكرولترا من هذه الثقافة على المادة الكيميائية التي تحتوي على أجار في آبار صفيحة الحوت 12 وانتشر بالتساوي باستخدام حبات زجاجية معقمة أو قضيب معقم. اترك اللوحة تجف تحت اللهب ثم احتضن اللوحة على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد انقضاء وقت الحضانة ، قم بتقييم العدد الإجمالي وحجم المستعمرات في الآبار.

حدد تركيزا شبه مميت للمركب لا يمنع النمو بأكثر من 10 إلى 15٪ لاستخدامه في الشاشة. حافظ على معدل طفرة الحذف بكثافة 384 مستعمرة لكل لوحة عن طريق النسخ المتماثل على 16 لوحة أجار YEPD ، تحتوي على 200 ميكرولتر لكل مليلتر من G four 18. استخدام نظام آلي للصفيف الميكروبي أو أدوات التثبيت اليدوي كل ثلاثة أشهر.

قم بتخزين الأطباق على حرارة أربع درجات مئوية لحين الحاجة. ثم قم بإعداد 250 مل من وسائط أجار YEPD بنفس تركيز G أربعة 18 أو خمسة ألواح أجار ، واتركها لتبرد طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو مستو. قم بإزالة الألواح التي تحتوي على مجموعة متحولات الحذف من التخزين عند أربع درجات مئوية واترك الألواح تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

استخدم مناديل مهمة دقيقة لإزالة أي تكاثف يتكون على غطاء كل لوحة لمنع ترسيب قطرات الماء على المصفوفة والتلوث المتبادل لطفرات المصفوفة. اطلب من روبوت تثبيت المصفوفة الميكروبية تكثيف مجموعة طفرة الحذف من كثافة 384 مستعمرة لكل طبق على 16 طبقا من أطباق بتري إلى 1،536 مستعمرة لكل طبق على أربعة أطباق بتري. بعد احتضان المصفوفة عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، افحص المصفوفة لضمان النقل المنتظم للمستعمرات من لوحات المصدر.

سيكون هناك العديد من المواضع الفارغة المدمجة في المصفوفة ، والتي تعمل كدليل على أن مصفوفة الحذف المتحولة قد تم تكثيفها بشكل صحيح. ستكون هذه هي لوحات المصدر المستخدمة للنسخ المتماثل على الوسائط التي تحتوي على مركب اهتمامك. يمكن استخدام لوحة مصدر واحدة لتثبيت متعددة.

أيضا ، تحتوي العديد من الروبوتات على ميزات إزاحة تسمح ، مما يضمن نقل عدد مماثل من الخمائر في كل مرة. لإعداد إصلاح المصفوفة المتحولة لحذف لوحة النسخة المتماثلة ، 700 مل من مركبة التحكم فقط وأجار YEPD التجريبي الذي يحتوي على المادة الكيميائية ذات الأهمية. هذا يكفي لإجراء الاختبار في ثلاث نسخ.

صب الألواح باستخدام أجار التحكم والتجريبي. إضافة 50 مل لكل طبق. اترك الألواح تبرد في درجة حرارة الغرفة طوال الليل على سطح مستو ومستو ، باستخدام الروبوت لتكرار اللوحة.

بتلقيح المصفوفة الطافرة المزدوجة على ثلاث مجموعات من الألواح التي تحتوي على مواد كيميائية بالتركيز المحدد تجريبيا ، بالإضافة إلى إعادة ضبط الألواح التي تحتوي على التحكم في السيارة. احتضن الألواح الموجودة على سطح المقعد في درجة حرارة الغرفة لما مجموعه 24 إلى 48 ساعة من الصورة. الألواح هي 24 و 48 ساعة من الحضانة عن طريق إزالة الغطاء ووضع وجهها لأسفل على ماسح ضوئي مسطح.

التقط صورا بدقة لا تقل عن 300 نقطة في البوصة. بدلا من ذلك ، استخدم كاميرا رقمية لالتقاط الصور. إذا قمت بذلك ، ضع الألواح متجهة لأعلى على خلفية داكنة وقم بإزالة الأغطية للصورة.

ثم قم بإجراء القياس الكمي والمقارنة بين أحجام مستعمرات المصفوفة باستخدام أحد البرامج المفتوحة المصدر العديدة ، بما في ذلك أدوات SGA الكروية ومطحنة الشاشة. في هذه المرحلة ، ستسجل العديد من طفرات حذف الخميرة درجة شديدة الحساسية للمادة الكيميائية ذات الأهمية التي تخرج الطفرات شديدة الحساسية المرغوبة من مجموعة حذف الخميرة إلى YEPD. يحتوي العمر على 200 ميكروغرام لكل ميكرولتر من G four 18 يحتضن عند 30 درجة مئوية حتى تتشكل المستعمرات.

بعد التحقق من النمط الجيني للسلالة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي والرحلان الكهربائي Agel ، قم بتلقيح خمسة ملليلتر من سائل YPD مع كل سلالة واحتضانه طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع الدوران أو الاهتزاز. قم بقياس OD 600 لكل مزرعة وقم بتخفيف كل سلالة إلى OD 600 من واحد في الماء المقطر المعقم. هذه هي الآن ثقافات الخميرة الطبيعية.

بعد ذلك ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من النوع البري الطبيعي بواسطة 4 7 4 1 ثقافة الخميرة إلى البئر A واحد من 96 لوحة بئر توزع 100 ميكرولتر من ما يصل إلى سبع سلالات إضافية إلى الآبار ، B واحد إلى H واحد. بعد ذلك ، قم بتوزيع 90 ميكرولترا من الماء المعقم على الآبار ، من A اثنين إلى H اثنان من خلال ستة إلى H ستة. أخيرا ، قم بإعداد سلسلة من واحد إلى 10 مخففات من منحوتات G الطبيعية.

ابدأ بسحب 10 ميكرولترات من العمود الأول إلى العمود الثاني بشكل متسلسل باستخدام ماصة متعددة القنوات واستمر عبر لوحة البئر 96 حتى يتم إجراء ستة تخفيفات. ثم استخدم الماصة متعددة القنوات لاثنين إلى خمسة ميكرولتر من مزارع الخميرة المخففة في شبكة على YEP D's ، وهي وسائط صلبة تحتوي على تحكم كيميائي ومركبات. احتضان الألواح في درجة الحرارة المناسبة لمدة 24 إلى 48 ساعة بعد الحضانة.

افحص اللوحات وقارن حساسية الطفرات المختارة للمواد الكيميائية بالنسبة للوحات صور التحكم BY 47 41 في 24 و 48 ساعة. كما كان من قبل ، تظهر الصور التالية نتائج الإجراء لتحديد التركيز المثبط للمادة الكيميائية subin. تظهر الصورة الأولى نمو ثقافة مشبعة بمقدار 4 7 4 1 مخففة من واحد إلى 5 ، 000 ومطلية بتركيزات متزايدة من خمسة فلورو يوراسيل.

يتم اختيار تركيز 10 ميكرومولار كجرعة مثبطة فرعية. توضح هذه الصورة منحنى نمو BY 4 7 41 خلية في وسط سائل يحتوي على خمسة فلورو يوراسيل. تم ترسيب ما يقرب من أربعة أضعاف 10 إلى الخلايا الأربع في ثلاث نسخ وتركيزات متزايدة من خمسة فلورو يوراسيل وتم قياس الكثافة البصرية كل 10 دقائق لمدة 22 ساعة.

مرة أخرى ، يمكن ملاحظة أن جرعة 10 ميكرومولار هي الجرعة المثبطة للسوبين. تظهر هذه الصور التالية النتائج من علم الوراثة الكيميائية الأخضر لخمسة فلورو يوراسيل. هنا ، يتم عرض مصفوفة متحولة لحذف S sachar visier تم نسخها على أجار YPD تحتوي على 10 ميكرومولار خمسة فلور يوراسيل على اليمين وتحكم DMSO على اليسار.

يوضح هذا الرسم البياني نتائج علم الوراثة الكيميائية الأخضر ، والنمو النسبي للطفرات على 10 ميكرومولار. يتم ترتيب خمسة فلور يوراسيل مقارنة بتحكم DMSO بواسطة موضع الشعاع هنا. يتم ترتيب النمو النسبي للطفرات على 10 ميكرومولار ، وخمسة نباتات يوراسيل مقارنة بالتحكم في DMSO حسب نسبة حجم المستعمرة.

يشار إلى عتبة نسبة أقل من 0.8 في كلا الرسم البياني. توضح هذه الصورة النهائية نتائج ثلاثة فحوصات للتحقق من الصحة. نمت التخفيفات التسلسلية للعديد من السلالات الطافرة المعزولة على التحكم في DMSO على اليسار ، و 10 ميكرومولار ، وخمسة فلورو UIL في الوسط و 0.015٪ سلفونات ميثان ميثيل على اليمين.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من أنك تعمل مع نسخة موثوقة من مصفوفة الحذف المتحولة أيضا للتحقق من صحة أي نتائج باستخدام منهجية مستقلة مثل فحوصات اكتشاف الخميرة أو تشريح الخميرة الرباعي. توفر هذه التقنية وسيلة فعالة للعلماء في مجال أبحاث الجزيئات الصغيرة لاستكشاف طريقة عمل المركب باستخدام مناهج مستوى الأنظمة في الخميرة الناشئة.