عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

مرحبا ، اسمي هيلين كوستر وأنا أعمل في مجموعة أبحاث القلب والأوعية الدموية للدكتور هارولد والأستاذ في جامعة أوتو فيكا في ماك بوك. نحن مهتمون بتوصيف عزل الخلايا الوحيدة البحرية من أجل استخدامها للمركبات في نمو السفن الجانبية. الخطوات الرئيسية التالية ضرورية لزراعة الخلايا الوحيدة المشتقة من نخاع العظام ، وتخدير الفأر الأول وخلع عنق الرحم ، والاستخراج الثاني وشطف عظم الفخذ.

الترشيح الثالث لنخاع العظام. رابعا لغسل الخطوات بمتوسط الخامس ، زراعة الخلايا على ألواح مرفقة منخفضة للغاية. قياس التدفق الخلوي السادس.

من أجل استخراج الخلايا الوحيدة من نخاع العظام ، سيتم تخدير الفأر باستخدام فلور ISO والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم. سيتم إصلاح الفأر ويتم فصل كلا الطرفين السفليين بمشرط الستيرويد. تم حصاد كل من عظم الفخذ والساق وغسلها باستخدام 96٪ إيثانول إيثان لمدة 90 ثانية على الأقل.

بعد ذلك ، يجب أن تكون جميع الخطوات معقمة تماما لتجنب التلوث. ستتم إزالة العضلات أو الأوتار من العظام. يتم شطف عظم الفخذ والساق ب PBS الدافئ لعدة مرات.

لحصاد نخاع العظام ، يتم قطع الأطراف القريبة والبعيدة لكل عظم بمقص ناعم. من أجل شطف العظام ، نحتاج إلى إبرة واحدة من الستيرويد 28 جم ، وحقنة واحدة ، وحقنة واحدة من المليلتر ، وما بين 10 إلى 15 مليلتر من الوسط لكل عظم. بعد ذلك ، يتم ترشيح نخاع العظم من خلال 70 ميكرومتر S مع إمساك العظم بالملقط الدقيق.

اشطف العظام واحدة تلو الأخرى حتى تتحول إلى الوهم. من أجل تقليل إجهاد الخلية ، قم بالضغط بعناية على ختم المحقنة. اشطف السيت باستخدام PBS.

بعد ذلك ، يتم الطرد المركزي للخلايا عند 250 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وهل يتم تعليق ريوس مع المتوسط؟ بعد هذه الخطوة ، كرر الخطوة مرة أخرى.

بالنسبة للخلايا الوحيدة المشتقة من نخاع العظم من نخاع العظام الأصلي ، نستخدم M 199 مع 1٪ بنسلين وستربتومايسين و 10٪ مصل سعال الجنين. بالإضافة إلى ذلك ، نضيف 20 نانوجرام لكل مليلتر INE MCSF في اليوم الأول. تضاف ثمانية نانوجرام لكل مليلتر من جاما التداخل في اليوم الأخير من الثقافة إلى الوسط.

إذا كنت ترغب في تنظيم معقد التوافق النسيجي الكبير ، يتم زرع الخلايا في ألواح تعلق منخفضة للغاية مع آبار سميكة لمنع الالتصاق الدائم بالقاع. نستخدم تركيزا مقداره مرة واحدة 10 أس الخلايا الست لكل مليلتر مع ما يصل إلى ستة ملليلتر لكل بئر. فترة الزراعة خمسة أيام عند درجة حرارة 37 درجة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

يتم فحص الخلايا يوميا بعد خمسة أيام بين 60 إلى 80٪ من الخلايا هي خلايا أحادية. اسمي مارتن باخنر وأنا طالب دكتوراه هنا في جامعة Auto Fungi في قسم أمراض القلب وعلم التشريح والتسلسل الزمني. وعندما تقوم بالحقن في الوريد ، من المهم أن تتدرب كثيرا قبل القيام بذلك وإلا فلن تتمكن من تطبيق الخلايا الوحيدة بطريقة مناسبة.

أظهرت التجارب أن الخلايا الوحيدة هي الأكثر فاعلية في تحسين عدم تكوين الفن عند تطبيقها بشكل منهجي. طريقة شائعة لتطبيق الدواء الجهازي هي حقن الذيل WA. في حالتنا ، نقوم بحقن 2.5 مليون خلية وحيدة ، والتي يتم تعليقها وكلوريد الصوديوم.

هناك أربع أوعية في ذيل شرايين الفأر في الجانب البطني والظهري ، واثنتان تتضاءل على الجانب الجانبي. لذلك بالنسبة لحقن WA ، علينا أن ندير الذيل لحوالي 90 درجة. لتسهيل الإجراء ، يجب تسخين الماوس باستخدام وسادة تدفئة لمدة 10 دقائق تقريبا.

يجب ملاحظة عن طريق الاحترار. هذا مهم للتعرف على علامات ارتفاع درجة الحرارة. علاوة على ذلك ، نحتاج إلى عامل العدوى هذا وإبرة 30 جينا على حقنة أنسولين سعة مليلتر واحد.

قم بإصلاح بعناية في مقيدة ، مما يجعل من السهل حقنه في طريق الذيل. تأكد من حصول الماوس على مساحة كافية للتنفس قبل تحميل المحلول في المحقنة. دوامة ، محلول الخلية الأحادية للتأكد من إمكانية حقن جميع الخلايا الوحيدة.

يطهر موقع الحقن لتجنب العدوى ، خذ الذيل بين الضربة والسبابة. في أقصى نقطة ، يتم إدخال الإبرة بزاوية مسطحة. إذا تم وضعه في الوريد ، فمن السهل جدا حقن محلول الخلية الوحيدة.

إذا كانت هناك نفطة ، فهذه علامة على الحقنة الخاطئة. يجب أن تتوقف على الفور وتحاول المزيد. قريب ، حاول دائما حقن بطيء ولا يزيد عن خمسة ميكرولتر لكل جرام.

إذا نجح الحقن ، أوقف النزيف في موقع الحقن عن طريق الضغط اللطيف لمدة دقيقة واحدة تقريبا. في نهاية الإجراء ، افتح الضام وضع الفأر في قفصه لتوصيف الخلايا الأحادية. نستخدم التأثيرات مع مزيج من المستضدات ، وهي CD 11 B و F four 80 و CD 115 و GL one.

يرتبط التعبير عن هذه المستضدات بمرحلة التطور لتحليل الخلايا الوحيدة. لقد فعلنا الحقائق في اليوم 0 و 3 و 5 و 7 ، ويزداد نقاء الخلية الأحادية بنسبة تصل إلى 90٪ في اليوم الخامس. لتحقيق هذا النقاء ، من المهم استنفاد البلاعم التيرين بقوة.

يتم استنفاد الخلايا غير التيرين باستخدام مخزن الغسيل الخالي من EDTA. لاستنفاد الخلايا التيرينية ، نستخدم EDTA التي تحتوي على الغسيل والمخزن المؤقت والمداعبة اللطيفة. يوضح هذا الرسم البياني أنواع الخلايا الرئيسية لثقافتها ذات الطرف الواحد.

أنواع الخلايا المختلفة المعروضة هي الخلايا الليمفاوية الواحدة ، واثنين من الخلايا الوحيدة ، وثلاث خلايا حبيبية ، مما يزيد من نقاء الخلايا الوحيدة بعد اليوم الخامس. والثقافة. لاحظ أن التركيب الخلوي المتغير أثناء زراعة الخلايا يشمل خلية وحيدة واحدة واثنين من الضامة.

الشكل الثاني ، الجدول الزمني لتعبير CD 115 أثناء التمايز. لاحظ أن أكثر من 95٪ من جميع الخلايا إيجابية CD 115 بعد خمسة أيام من التمايز ، مما يشير إلى أن الغالبية العظمى من الخلايا إما خلايا وحيدة أو ضامة. يمكن أن يعتمد التصنيف على حجم الخلية والحبيبات ، لكن العلامات الخلوية المحددة أكثر موثوقية.

الشكل الثالث ، زيادة التعبير عن نضج البلاعم أحادي الخلية. ماركر F أربعة 80 ، اليوم الخامس ، لاحظ ظهور مجموعة سكانية ذات تعبير متوسط F أربعة 80 ، وهو ما يتوافق مع النمط الظاهري للخلايا الوحيدة. اليوم السابع ، لاحظ التحول الصحيح لتعبير F four 80 بما يتوافق مع نضوج البلاعم.

يعد عزل الخلايا الوحيدة أمرا ضروريا للعديد من الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي. هذه الخلايا هي هدف مثير للاهتمام ، على سبيل المثال ، فيما يتعلق بأمراض مثل أمراض الشرايين الطرفية أو أمراض القلب التاجية ، والتي ترتبط بنقص التروية. يتم حصاد نخاع العظام من الوكالة الفيدرالية لإدارة الطوارئ (FEMA) وساق الفئران الخزعة عن طريق تنظيف العظام بتعليق الخلية المتوسطة الدافئة ، ويتم استكمالها ب MCSF ويتم زراعتها على أسطح التعلق منخفضة للغاية لتجنب الالتصاق ، مما يؤدي إلى تمايز خصائص الخلايا الوحيدة ، ويتم فحص تمايز الخلايا الوحيدة في أوقات مختلفة وتستخدم الحقائق مع علامة مثل CD 11 b و CD 115 و FO 80 للتنميط الظاهري للخلايا.

إذا كان توصيل الدواء الجهازي مطلوبا ، فإن الحقن الوريدي هو طريقة سهلة وفعالة للقيام بذلك. وصفنا طريقة عزل كميات كبيرة من الخلايا الوحيدة MI من نخاع العظام بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. باستخدام هذه الطريقة الجديدة ، يمكننا توليد حوالي 11 مليون خلية وحيدة لكل فأر.