طرائق لتقييم السمسة والمناعة من احتراق التبغ الاستعدادات المنتج

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم تأثيرات تحضير منتج التبغ على إفراز السيتوكين وقتل الخلايا المستهدفة بواسطة P BMCs. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة P BMCs المزروعة أولا بحالة دخان كاملة ، متوسطة أو نيكوتين ، ثم يتم إجراء تلطيخ داخل الخلايا ل p BMCs المعالجة لتحديد إنتاج السيتوكين الخاص بها. بدلا من ذلك ، فإن الخلايا CFSE المسماة K 5 62 هي زراعة مشتركة مع خلايا مستجيب PBMC المعالجة بوسط الدخان الكامل ، وصلاحية خلايا K 5 62 مؤهلة من خلال سبعة تلطيخ A a.

في النهاية ، يتم قياس تأثيرات مستحضرات منتجات التبغ القابلة للاحتراق على P BMCs من أي من المقايسين عن طريق قياس التدفق الخلوي. المزايا الرئيسية لتقنياتنا أو الأساليب الحالية ، مثل مقايسة إطلاق الكروم أو بقعة ALI هي أن أساليبنا عالية الإنتاجية وغير مشعة ، ويمكننا قياس وظائف الخلية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للتأثيرات البيولوجية لمستحضرات منتجات التبغ.

يمكن أيضا تطبيقه على تقييم المركبات الأخرى التي تؤثر على وظائف مستقبلات متشابهة ووظائف STIC لخلايا مستجيب PBMC قبل البدء في إجراء التلوين. تمييع حالة الدخان الكامل ، المتوسطة والنيكوتين بالتركيزات المدرجة. في RPMI ، متوسط كامل إلى حجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر في لوح 96 بئر.

ثم أضف 100 ميكرولتر من P BMCs ، معلقة في وسط كامل بتركيز واحد في 10 إلى الخلايا الست لكل بئر بحجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر لكل بئر. بعد ذلك ، قم بتغطية اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ثلاث ساعات ، اغسل الخلايا وشفط المادة الطافية.

ثم قم بتغطية اللوحة مرة أخرى وقم بدوامها لفصل الكريات. اغسل الخلايا مرتين أخريين ، مرة في المخزن المؤقت البارد ، ومرة واحدة في وسط كامل بعد الغسيل الثاني. عالجهم ب 200 ميكرولتر لكل بئر من الوسط الكامل المكمل بقابس جولجي و LPS لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

ثم اغسل الخلايا بمحلول تشغيل مثلج بارد وعالجها ب 100 ميكرولتر من سيتو في كل بئر عند أربع درجات مئوية بعد 20 دقيقة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات بغسول بيرم مثلج بارد. ثم أضف 45 ميكرولترا من تجعيد السيتو إلى كل بئر متبوعا بخمسة ميكرولترات من كل من الأجسام المضادة المدرجة. بعد 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخلايا ثلاث مرات وثبتها في 200 ميكرولتر من البرد المثلج ، 2٪ بارا فورمالديهايد.

ثم انقل الخلايا إلى أنابيب 12 × 75 ملم وقم بتحليل العينات على مقياس التدفق الخلوي. بعد تحضير طبق من منتج التبغ المعالج pbmc كما هو موضح للتو ، اغسل مزرعة K 5 62 خلية ، تم حصادها بطلاقة 80٪ في 10 ملليلتر من DPBS. ريسوس. الحبيبات في خمسة ملليلتر من DPBS وعد الخلايا.

ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول عمل CFSE المحضر حديثا إلى مرة إلى مرتين 10 إلى الخلايا السابعة K 5 62 في مليلتر واحد من الوسط الكامل وتفريق بقعة الخلية عن طريق الدوامة. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة بعد دقيقتين بالضبط ، وأضف 200 ميكرولتر من FBS وقم بدوامة الخلايا مرة أخرى ، واحتضانها لمدة دقيقتين أخريين. بعد الحضانة الثانية ، اغسل الخلايا في 10 مل من الوسط الكامل ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر أخرى من الوسط الكامل وعد الخلايا.

الآن الطرد المركزي التبغ معالجة p BMCs وصب الطافف. ثم استبدل الغطاء ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق الدوامة واغسلها في 200 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل بئر. لبدء اختبار القتل ، أضف CFSE المسمى K 5 62 خلية إلى pbmc بنسبة واحد إلى 15 واحتضان الزراعة المشتركة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

بعد خمس ساعات ، قم بتدوير الخلايا وتخلص من المادة الطافية. قم بتعليق الكريات عن طريق الدوامة ثم اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتشغيل لكل بئر ثم أضف 95 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتشغيل ، متبوعا بخمسة ميكرولترات من سبعة A a d لحجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر. أخيرا ، احتضان الخلايا في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

ثم أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الجاري إلى كل بئر وانقل الحجم بالكامل إلى أنابيب الفاكس المقابلة المناسبة لتحديد النسبة المئوية لسبعة خلايا موجبة أ أ و د و CFSE. عن طريق تحليل التدفق الخلوي ، لوحظت زيادة تعتمد على الجرعة في موت الخلايا مع وسط مكيف بالدخان الكامل في 24 ساعة مع ما يقرب من 80٪ من الخلايا الميتة عند أربعة ميكروغرام لكل مليلتر من وحدات نيكوتين الخيول. ومع ذلك ، فإن معالجة p BMCs لمدة ثلاث ساعات فقط لا تؤدي إلى سمية كبيرة حتى عند خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من وحدات نيكوتين الخيول من وسط مكيف بالدخان الكامل في 24 ساعة.

لم يتم ملاحظة درجة مماثلة من موت الخلايا قبل العلاج ب 3000 ميكروغرام لكل مليلتر من النيكوتين بعد ثلاث ساعات ، ولا يتسبب علاج النيكوتين في موت الخلايا القابل للقياس قبل معالجة تركيز 2000 ميكروغرام لكل مليلتر مع حالة الدخان الكامل ، المتوسطة والنيكوتين ، متبوعا بتحفيز مستقبلات TLR الأربعة بواسطة LPS يؤدي إلى انخفاض يعتمد على الجرعة من السيتوكينات المفرزة. على الرغم من أن درجة القمع تختلف بين السيتوكينات الفردية. علاوة على ذلك ، عندما يتم معالجة الخلايا ب LPS و Golgi plugs لمدة ست ساعات فقط ، لوحظ انخفاض في عدد الخلايا الإيجابية للسيتوكين داخل الخلايا بعد التعرض لوسط حالة الدخان الكامل ، حتى عند تركيزات وحدة النيكوتين المنخفضة للخيول مقارنة بالتعرض للنيكوتين.

في الواقع ، توضح نتائج اختبار القتل هذا أن التعرض ل 1.56 ميكروغرام لكل مليلتر من وسط حالة الدخان الكامل يقلل بشكل كبير من قدرة القتل لمجموعة PBMC المستجيبة مقارنة بالتحكم وتركيزات الجرعة المنخفضة. في حين أن علاج النيكوتين بتركيزات عالية أو منخفضة لا يتداخل مع قدرة القتل للمستجيب PBMC أثناء محاولة هذه الإجراءات. من المهم أن تكون دقيقا مع وضع العلامات على CFSE بالإضافة إلى تخفيفات الأجسام المضادة ووضع العلامات على وقت ودرجات حرارة الحضانة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنيات وضع العلامات على الأجسام المضادة في قياس التدفق الخلوي لتحديد تأثيرات مستحضرات منتجات التبغ أو العلاجات الأخرى على خلايا الدم المحيطية أحادية النواة.