الكهربية والمورفولوجية توصيف العصبية الحادة رقائق في الدماغ عن طريق شرائح الموثوقة التصحيح، المشبك التسجيلات
يناير 10, 2015
وملء السيتين الحيوي المتزامن داخل الخلايا للخلايا العصبية المقترنة متشابك في شرائح الدماغ الحادة بتحليل مرتبط لخصائصها الهيكلية والوظيفية. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف الخطوات التقنية الأساسية للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي من الدوائر الدقيقة العصبية وتحليلها المورفولوجي اللاحق.
الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح كيفية تمييز الروابط المشبكية بين الخلايا العصبية المحددة شكليا من الناحيتين الوظيفية والهيكلية. يتم تحقيق ذلك من خلال الحصول على شرائح دماغية حادة ، والتي تم تحسينها لدراسة اتصال متشابك معين. ثم يتم استخدام لقط التصحيح لاختبار الخلايا العصبية المقترنة متشابك.
لهذا الغرض ، يتم تصحيح خلية عصبية فردية محتملة بعد التشابك ، ثم يتم استخدام ماصة ثانية لتحفيز الخلايا العصبية المحيطة من أجل إثبات وجود اتصال متشابك. إذا لم تظهر أي استجابة ، يتم تحريك القطب المحفز. بمجرد العثور على اتصال ، يتم إعادة مطابقة الخلايا العصبية قبل المشبكية في وضع البيع بالجملة.
بعد التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية من هذه الخلايا العصبية وحشوات البيوتين المتزامنة ، يتم إصلاح الشريحة ومعالجتها من أجل البيوتين ويتم إجراء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد بمساعدة الكمبيوتر للخلايا العصبية. في النهاية ، تهدف طريقتنا إلى تحليل كمي هيكلي ووظيفي مرتبط للدوائر الدقيقة العصبية. الميزة الرئيسية للتسجيلات المزدوجة من الخلايا العصبية المقترنة متشابكيا هي أنه يمكننا إجراء تحليل هيكلي ووظيفي مرتبط لكل من الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي في الدوائر العصبية الدقيقة.
حتى في الآونة الأخيرة ، التقنيات التي تم إدخالها مثل التحفيز البصري للخلايا العصبية غير قادرة حتى الآن على تحقيق ذلك بنفس القدر من التفاصيل. تتيح هذه الطريقة دراسة تفاعلات الإثارة والتثبيط لأنواع الخلايا العصبية المحددة شكليا وكيفية تعديل النشاط. وتوضيح إجراءات تسجيلات الأليفة سيكون قوان.
هو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. بعد تحضير شرائح من المنطقة المستهدفة ، اسمح لها بالحضانة خلال هذا الوقت ، واسحب ماصات التصحيح ، والتي يجب أن يكون لها ساق طويلة ونحيلة. بعد تأمين شريحة دماغية بقيثارة بلاتينية في غرفة تجريبية ، املأ ماصة التسجيل بمحلول داخلي.
ضع الماصة في مكبر الصوت المسبق وقم بتصحيح خلية عصبية مفترضة بعد التشابك في وضع الخلية بأكملها باستخدام ماصة رقعة بحث من ثمانية إلى 10 ميجا أوم مقاومة مملوءة بمحلول داخلي يتم فيه استبدال أملاح البوتاسيوم بأملاح الصوديوم. ضع شفطا لطيفا على الماصة الباحثة لتصحيح خلية عصبية محتملة قبل المشبكي في خلية فضفاضة. التكوين المرفق.
امسك إمكانات الغشاء تحت الختم السائب بين سالب 30 سالب 60 مللي فولت في وضع المشبك الحالي. ثم قم بتطبيق نبضات تيار كبيرة من 0.2 إلى اثنين من النانو أمبير لاستنباط جهد فعل في الخلية قبل المشبكي المحتملة. لاحظ إمكانات الفعل هذه كسنيبلات صغيرة على استجابة الجهد.
اضبط تردد التحفيز على 0.1 هرتز لمنع انخفاض استجابة ما بعد المشبكي. إذا لم تستجب الخلايا العصبية بعد المشبكي لتحفيز رقعة الخلايا العصبية قبل المشبكية التي يحتمل أن تكون مختبرة ، فإن خلية عصبية محتملة جديدة قبل المشبكي في وضع الختم الفضفاض. اختبر ما يصل إلى 30 خلية عصبية قبل المشبكية بهذه الطريقة.
الاستمرار في استخدام نفس قطب تصحيح البحث طالما يمكن إنشاء ختم بمقاومة أكبر من 30 ميجا أوم. إذا أدى التحفيز في وضع الختم السائب إلى EPSP أو IPSP بزمن انتقال أقل من خمسة مللي ثانية في الخلايا العصبية بعد المشبكي ، فقم بإزالة ماصة البحث من الخلايا العصبية قبل المشبكية باستخدام قطب رقعة تسجيل مملوء بمحلول داخلي منتظم يحتوي على محلول داخلي منتظم بمقاومة من أربعة إلى ثمانية ميجا أوم. قم بتصحيح الخلايا العصبية قبل المشبكية وسجلها في وضع المشبك الحالي للخلية بأكملها.
استنباط إمكانات العمل عن طريق الحقن الحالي في الخلايا العصبية قبل المشبكية وتسجيل استجابة ما بعد المشبكي. قم بتخزين البيانات على جهاز كمبيوتر لتحليلها لاحقا دون اتصال. طوال التسجيل ، ينتشر البيوتين في الخلايا العصبية للحصول على تلطيخ مناسب.
اسمح للبيوتين بالانتشار لمدة 15 إلى 30 دقيقة على الأقل حسب حجم الخلايا العصبية. بالنسبة للدوائر الدقيقة العصبية ذات نسبة الاتصال العالية ، لا يتم استخدام قطب بحث. بدلا من ذلك ، ابدأ بترقيع خلية عصبية قبل المشبكية مباشرة في وضع الخلية بأكملها.
ثم باستخدام قطب كهربائي مليء بمحلول داخلي منتظم ، خلية عصبية محتملة بعد المشبكي أيضا في وضع الخلية بأكملها ، يجب أن تكون كلتا الخليتين تحت سيطرة المشبك الحالي. استنباط جهد فعل في الخلية قبل المشبكية ومراقبة الخلايا العصبية المحتملة بعد المشبكي للحصول على إمكانات ما بعد المشبكي. إذا لم تظهر الخلايا العصبية استجابة للتحفيز قبل المشبكي ، فاستخدم قطبا كهربائيا جديدا لتصحيح خلية عصبية جديدة مرة أخرى في وضع الخلية بأكملها.
عند العثور على توصيل، تابع التسجيل كما هو موضح سابقا دون تغيير ماصة التصحيح. بعد تثبيت الشرائح وتركيبها كما هو موضح في بروتوكول النص ، افحص الخلايا العصبية المسماة بالبيوتين تحت المجهر الضوئي. تأكد من أن الهراوات المحورية والعمود الفقري الشجيري مرئية بوضوح.
باستخدام نظام تتبع الخلايا العصبية التجارية ، تتبع الخلايا العصبية يدويا أو أزواج الخلايا العصبية المقترنة متشابكة. تأكد من تضمين حتى الضمانات المحورية أو الشجيرية الصغيرة. استخدم الآثار للحصول على إعادة بناء الخلايا العصبية ثلاثية الأبعاد ، وتصحيح إعادة بناء الخلايا العصبية للانكماش في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة في القسم المناسب من برنامج التتبع.
عوامل تصحيح الانكماش لوسط التضمين هي حوالي 1.1 للاتجاهين x و y ، وحوالي 2.1 للاتجاه Z. زوج خلية مقترن بشكل متبادل يتكون من نجمة شوكية وارتفاع سريع في الخلايا العصبية. في الطبقة القشرية الرابعة كانت مليئة بالبيوتين.
أثناء التسجيل ، تشير النقاط الخضراء إلى اتصالات متشابكة مثيرة مفترضة بين الخلايا العصبية الشوكية قبل التشابك والخلايا العصبية بين ما بعد التشابك. تشير النقاط الزرقاء إلى جهات اتصال متشابكة مثبطة متبادلة مفترضة. يتم عرض صور عالية الطاقة لجهات الاتصال المشبكية هنا.
تظهر الدوائر الخضراء المفتوحة جهات اتصال مثيرة وتظهر الدوائر الزرقاء المفتوحة جهات اتصال مثبطة. يظهر هنا إعادة بناء العصبية الواضحة لهذا الزوج الخلوي المتصل بالتبادل. يظهر محور الخلايا العصبية بين الخلايا العصبية باللون الأزرق ويظهر سوما وتغصناته باللون الأحمر.
يظهرمحور الخلايا العصبية الشوكي باللون الأخضر وسوما ودايت باللون الأبيض. يظهر الجزء الداخلي المقصورات المتغصنة السوماتية للخلايا العصبية قبل وبعد التشابك. جنبا إلى جنب مع جهات الاتصال المشبكية المفترضة ، تم تحديد ملامح البرميل في الصور المجهرية منخفضة الطاقة للمجال الساطع المصنوعة من شريحة الدماغ الحادة.
يظهرهنا اتصال متشابك تمثيلي بنسبة اتصال منخفضة جدا. أثار جهد الفعل قبل المشبكي في خلية شبه معدنية من الطبقة السادسة إمكانات ما بعد المشبكي المثيرة أحادية المشبكية في طبقة من الخلايا العصبية البارافلزات ذات الأربع نجوم. زمن الوصول الموضح هنا لأكثر من ثلاثة مللي ثانية من هذا الاتصال الصفحي العابر أطول بكثير من زمن انتقال مللي ثانية تقريبا الذي لوحظ في الاتصالات المحلية داخل الصفيحة.
أثارت إمكانات عمل عند 10 هرتز في الطبقة السادسة من الخلايا شبه المعدنية إمكانات ما بعد التشابك في طبقة الخلايا العصبية الصغرى من النجوم الأربعة الموضحة هنا. لاحظ التيسير قصير الأجل. من المهم أن تتذكر أن حالة القطع تحتاج إلى تحسين لاتصال متشابك معين ، وأنه أثناء التسجيل ، يجب أن يكون الإعداد مستقرا تماما ومن ثم يتم ضمان الفهم الأمثل للتسجيل.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام القياسات الفيزيولوجية الكهربية وإعادة البناء المورفولوجية للحصول على صورة شاملة للخصائص الهيكلية والوظيفية للدوائر العصبية الدقيقة في القشرة المخية الحديثة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يُظهر هذا البروتوكول توصيف الروابط التشابكية بين الخلايا العصبية المحددة شكليًا من خلال التحليل الكهربائي الفسيولوجي والهيكلي. باستخدام شرائح الدماغ الحادة، يمكن للباحثين تثبيت الخلايا العصبية الفردية وتحفيز الخلايا العصبية المحيطة لتأسيس روابط تشابكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكهربائية الفسيولوجية
- المورفولوجيا العصبية
الخلفية
- فهم الروابط التشابكية أمر بالغ الأهمية لأبحاث علم الأعصاب.
- تتيح تقنيات التثبيت بالرقعة التحليل الوظيفي التفصيلي للخلايا العصبية.
- توفر التحليلات المورفولوجية المتزامنة رؤى حول بنية الخلايا العصبية.
- تعتبر شرائح الدماغ الحادة مثالية لدراسة التفاعلات التشابكية.
هدف الدراسة
- وصف الخطوات التقنية للتسجيل الكهربائي الفسيولوجي.
- لربط الخصائص الوظيفية والهيكلية للخلايا العصبية.
- لتعزيز فهم الدوائر العصبية الدقيقة.
الطرق المستخدمة
- تحضير شرائح الدماغ الحادة لدراسة تشابكية مثالية.
- تسجيلات التثبيت بالرقعة لتحديد الخلايا العصبية المقترنة تشابكيًا.
- تعبئة البيوسيتين للتحليل المورفولوجي للخلايا العصبية.
- تحفيز الخلايا العصبية المحيطة لتأسيس الروابط التشابكية.
النتائج الرئيسية
- التعرف بنجاح على الروابط التشابكية بين الخلايا العصبية.
- تبيان العلاقة بين الخصائص الهيكلية والوظيفية.
- رؤى حول ديناميكيات الدوائر العصبية الدقيقة.
- تأسيس بروتوكول موثوق للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول مقاربة شاملة لدراسة الروابط التشابكية.
- يسلط الضوء على أهمية الجمع بين التقنيات الكهربائية الفسيولوجية والمورفولوجية.
- تسهم النتائج في فهم أعمق للتفاعلات العصبية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Paired patch-clamp recordings in acute brain slices enable direct, quantitative analysis of synaptic connectivity and functional microcircuit properties, supporting mechanistic de-risking in early neuroscience drug discovery. This approach provides high-resolution correlation between neuronal structure and function, informing target validation and predictive confidence for CNS portfolio decisions. Integrating electrophysiological and morphological data strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of synaptic connectivity and microcircuit function in disease-relevant brain regions.
- Supports mechanistic de-risking by correlating electrophysiological responses with neuronal morphology.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in CNS programs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated neuronal systems for downstream compound screening.
- Provides quantitative, reproducible electrophysiological and morphological outputs for assay standardization.
- Enables reliable evaluation of compound effects on synaptic transmission and connectivity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional and structural biomarkers for translational continuity in CNS research.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying microcircuit mechanisms underlying disease phenotypes.
- Informs preclinical model selection based on validated synaptic and circuit-level endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by providing quantitative, mechanistic insights into neuronal microcircuits, supporting lead identification and translational biomarker development in CNS pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of synaptic connectivity and pathway function in native tissue context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of synaptic responses for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of latency, amplitude, and connectivity for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns structural and functional endpoints for biomarker validation and model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing diverse neuronal circuits across CNS programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes electrophysiological and morphological workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage in neuroscience R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS assets based on validated circuit mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires specialized electrophysiology expertise and training in patch-clamp techniques.
- Demands access to advanced microscopy and neuron tracing infrastructure for 3D reconstruction.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of recording and analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or neuronal subtypes based on connectivity ratios.
- Connectivity estimates can be affected by tissue preparation artifacts such as dendritic or axonal truncation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:22
Paired Patch-Clamping: Neuronal Connections with a Low Connectivity
5:11
Paired Patch-Clamping: Neuronal Connections with a High Connectivity
6:16
Neuronal Reconstruction and Synaptic Contact Localization
7:17
Results: Morphology and Electrophysiology of Synaptic Connections in Cortical Neuronal Microcircuits
9:35
Conclusion
