تقييم الوظيفي للأعصاب البيولوجية في الثقافات الشبكية من الخلايا الجذعية المستمدة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا العصبية

الهدف من هذا الإجراء هو قياس تأثير السموم العصبية الكلوستريدية (Clostridial neurotoxins) بدقة على النقل المشبكي في مزارع شبكية من العصبونات المشتقة من خلايا جذعية جنينية للفئران. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تهيئة الخلايا الجذعية الجنينية في مزرعة تعليق خالية من الخلايا المغذية والحفاظ على الخلايا المهيئة في حالة متعددة القدرات. وتتمثل الخطوة الثانية في تمايز الخلايا الجذعية المهيئة للتعليق إلى عصبونات أو عصبونات مشتقة من خلايا جذعية جنينية (ESNs)، باستخدام تباين في تقنية التمايز الرباعية.

بعد ذلك، تُعالج الخلايا العصبية الجلدية (ESNs) بسلسلة من الأوساط الغذائية لتعزيز النضج والتحول إلى عصبونات شبكية نشطة مشبكيًا. وتتمثل الخطوة النهائية في معالجة الخلايا العصبية الجلدية بالسموم العصبية الكلوستريدية أو سموم عصبية أخرى، وقياس التأثيرات على النشاط المشبكي أحادي synapse باستخدام تقنية تسجيل الجهد الكهربائي عن طريق تثبيت الغشاء للخلية الكاملة (whole cell patch clamp electrophysiology). وفي النهاية، يتم قياس التغيرات في الإنتاج التلقائي للنشاط المشبكي أحادي synapse من خلال التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية التي تتم معايرتها وفقًا لعصبونات ضابطة مطابقة من حيث العمر والدفعة، ومقارنتها بين ظروف مختلفة مثل الجرعات، أو الأوقات، أو العلاجات الدوائية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن شبكات العصبونات الاستثارة (ESNs) هي أول نموذج خلوي يعيد تكرار الاعتلالات الوظيفية المسؤولة عن المظاهر السريرية للتسمم البوتيوليني والكزاز. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما وجدنا أن شبكات العصبونات الاستثارة (ESNs) كانت شديدة الحساسية لجميع السموم العصبية الكلوستريدية بناءً على انشطار بروتين snare، كما أظهرت نشاطاً مشبكياً تلقائياً في سلوك الشبكة الناشئ. ستقوم السيدة ميغان ليمان، الفنية من مختبري، بشرح الإجراء. ابدأ بنقل مزرعة معلقة مكيفة خالية من الخلايا المغذية.

تُجمع تجمعات الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter وتُترك حتى تترسب على شكل كريّة مدمجة. وبمجرد ترسب التجمعات، يُسحب السائل الطافي (SUP natant) مع الحرص على عدم تشتيت كريّة الخلايا. بعد ذلك، يُضاف 5 milliliters من محلول PBS لغسل الخلايا، ثم تُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 100 ×g لمدة 2.5 minutes.

قم بشفط PBS بعناية، ثم أضف 500 microliters من trypsin واقلب الأنبوب عدة مرات لتفكيك كتلة الخلايا بلطف. بعد ذلك، ضع الأنبوب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 degree Celsius واتركه للحضن لمدة ثلاث دقائق. بعد انقضاء وقت الحضن، أعد الأنبوب إلى غطاء زراعة الأنسجة وأضف 500 microliters من وسط ESC لتخفيف trypsin.

ثم قم بتقليب معلق CEL من خمس إلى 10 مرات باستخدام ماصة P 1000 للحصول على معلق خلوي أحادي. قم بعدّ عينة من الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم قم بطرد مركزي لما تبقى من معلق الخلايا عند 200 ×g لمدة ثلاث دقائق. بعد سحب الراشح، نقوم بتعليق الخلايا للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 × 10⁶ خلية/مل باستخدام وسط ESC.

بعد ذلك، انقل 150 µL من المعلق إلى 10 mL من وسط ESC في طبق بكتيري بقطر 10 cm، ثم قم بالتحضين عند 37 °C و5% CO2. يتم تمرير خلايا ESC بشكل روتيني باستخدام هذا البروتوكول. كل 48 ساعة، يبدأ تمايز خلايا ESC إلى عصبونات أثناء عملية تمرير الخلايا الروتينية.

قم بفصل الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) كما سبق، ولكن أضف طبقًا إضافيًا للتمايز العصبي. انقل 350 µL من معلق الخلايا إلى طبق بقطر 10 cm منخفض الالتصاق يحتوي على 25 mL من وسط التمايز (differentiation Medium). ضع الطبق على هزاز مداري مضبوط على 30 إلى 45 RPM داخل حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 °C و 5% CO2 واتركه في الحاضنة لمدة 48 ساعة.

بعد مرور 48 ساعة، استخدم ماصة سعة 25 milliliter لنقل تجمعات الخلايا المتمايزة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. أضف فوراً 25 milliliters من وسط التمايز الجديد إلى طبق بتري.

اترك التجمعات تترسب لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق، حتى يتكون راسب مرئي بعمق يتراوح من 1 إلى 2 مليمتر. اشفط الوسط بحذر، مع تجاهل أي خلايا مفردة أو تجمعات صغيرة لا تزال عالقة، واستخدم ماصة P 1000 لنقل كتلة الخلايا الراسبة مرة أخرى إلى طبق بتري. أعد الطبق إلى الهزاز الدوار داخل الحاضنة.

بعد مرور 48 ساعة أخرى، كرر إجراء تغيير الوسط الغذائي. استخدم هذه المرة 30 milliliters من وسط التمايز المضاف إليه ستة micromolar من حمض الريتينويك الكامل التحول (all trans retinoic acid). ستكون الراسبة المتكونة الآن بعمق يتراوح بين اثنين إلى أربعة millimeters بعد تحضين الخلايا.

كما سبق، كرر إجراء تغيير الوسط الغذائي مع إضافة حمض الريتينويك للمرة الأخيرة. ستكون الكتلة الخلوية بعمق يتراوح بين أربعة إلى ثمانية مليمترات في هذه المرحلة في اليوم التالي. قم بتجهيز أسطح الزرع كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول في بعد ظهر يوم الزرع، أو خمسة مليلترات من كل من وسط MPC التربسين المكسو مسبقاً ومثبط التربسين من فول الصويا بتركيز 0.1% عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

ثم استخدم ماصة سعة 25 milliliter لنقل التجمعات المتمايزة من طبق الزرع إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اترك التجمعات تترسب لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق، ثم قم بشفط الوسط بعناية دون تعكير الراسب. بعد ذلك، اغسل الراسب باستخدام 5 إلى 10 milliliters من PBS بعد ترسب التجمعات.

قم بشفط محلول PBS وكرر عملية الغسيل. بعد الغسلة الثانية بمحلول PBS، أضف خمسة مليلتر من وسط MPC ization إلى الراسب واحضنه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بنقر الأنبوب برفق من مرتين إلى ثلاث مرات أثناء التحضين. بعد ذلك، أضف خمسة ملليلتر من مثبط تريپسين فول الصويا بنسبة 0.1% إلى الخلايا واخلطها بسرعة عن طريق القلب. ثم قم بتفتيت الخلايا برفق من 10 إلى 15 مرة باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر حتى يتم الحصول على معلق خلوي متجانس نسبيًا.

قم بترشيح معلق الخلايا ببطء عبر مصفاة خلايا بمسام 40 أو 70 ميكرون موضوعة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مللتر. بعد ترشيح كامل المعلق، أضف 1 مللتر من وسط N2 إلى المصفاة لغسل الخلايا المتبقية عبرها. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مللتر وقم بإجراء عملية الطرد المركزي لمدة ست دقائق عند 200 ×g. بعد سحب الوسط دون تعريض الراسب للاضطراب، قم بتفتيت الراسب في 2 مللتر من وسط N2، ثم أضف وسط N2 حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 10 مللتر.

قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 ×g. اسحب الوسط وكرر عملية غسل الراسب مرة أخرى. قم بإعادة تعليق الراسب في 10 milliliters من وسط N two.

اسحب كمية صغيرة من الخلايا وقم بعدها باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer)، ثم كرر عملية الطرد المركزي. علّق الخلايا في وسط N two بتركيز نهائي قدره 1×10⁷ خلية/مل، وازرعها بكثافة تتراوح بين 150,000 و 200,000 خلية/سم². يتم تحضير هذا في اليوم DIV-1 ويوضع في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية.

يتم الحفاظ على الخلايا العصبية الحسية الجنينية (ESNs) وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب. أولاً، يتم تخفيف سم البوتولينيوم العصبي من النمط المصلي A إلى 100 ضعف التركيز النهائي المطلوب في وسط زراعة ESN، ثم يتم تدفئته إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك، يُضاف حجم مناسب من السم إلى مستنبتات DIV 21 بالإضافة إلى ESN.

قم بترطيب طبق المزرعة وأعده إلى الحاضنة في الوقت المطلوب. اسحب وسط استزراع ESN باستخدام الماصة، واغسل المزرعة مرتين باستخدام محلول تسجيل الخلايا خارج الخلوية أو ERB. ثم أضف أربعة milliliters من ERB المدعم بـ 5 micromolar من tetrodotoxin لمنع جهود الفعل و10 micromolar من bicuculline لمضادة نشاط مستقبلات gabaa.

بعد ذلك، انقل الطبق إلى منصة الفيزيولوجيا الكهربائية. لا يلزم استخدام التروية أو التحكم في درجة الحرارة لقياس تثبيط النقل التشابكي أو فحص MIST. بعد استخدام سحب الماصات الدقيقة لسحب ماصات سيليكات البورون بمقاومة تتراوح من 5 إلى 10 mega ohms، قم بملء الماصة من الخلف بمحلول تسجيل داخل الخلايا.

بعد ذلك، اغمس الماصة برفق في كاشف السيليكون. ثبّت ماصة التسجيل على حامل القطب، وقم بتوصيل محقنة مملوءة بالهواء بالأنابيب المتصلة بحامل القطب. وفّر ضغطاً إيجابياً ثابتاً عن طريق المحقنة أثناء خفض ماصة التسجيل في ERB.

بعد إنزال ماصة التسجيل برفق على منطقة مقاومة السطح (SOR) للعصبون المراد تسجيله، تحقق من الضغط الإيجابي عن طريق كسر الختم الموجود على المحقنة. أعد توصيل المحقنة وطبق ضغطاً سلبياً مستمراً من خلال سحب لطيف لتكوين ختم جيجا أوم (giga ohm seal).

بمجرد تشكيل ختم الجيجا أوم (giga ohm seal)، خفّض جهد التثبيت إلى 70- ملي فولت. بعد ذلك، قم بتطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي بعناية باستخدام المحقنة للانتقال إلى تكوين الخلية الكاملة (whole cell configuration). راقب طفرات السعة الكهربائية لمدة 30 ثانية للتأكد من استقرار الرقعة (patch).

قم بإلغاء تذبذبات السعة (capacitance spikes) في برنامج HEA وانتقل إلى وضع تثبيت التيار (current clamp mode) لمراقبة وتسجيل جهد الغشاء الراحي دون إجراء تعديل لجهود الوصلة السائلة. قد يتراوح جهد الغشاء الراحي بين 67- و 82- millivolts. اضبط الكسب (gain) على 2 millivolts لكل pico amp.

قم بالتحويل إلى وضع تثبيت الجهد (voltage clamp mode) وأجرِ تسجيلاً مستمراً عند -70 millivolts لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق للكشف عن التيارات الاستثارية المصغرة بعد التشابكية. قم بتحليل البيانات المسجلة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق للكشف عن me PSCs باستخدام الإعدادات الافتراضية لـ AMPA receptor EPCs في برنامج mini analysis، ثم اجمع واحفظ المعلومات المتعلقة بالأحداث المكتشفة. بعد ذلك، قم بجمع ترددات M-E-P-S-C لثماني إلى 12 عينة ضابطة وثماني إلى 12 عينة معالجة بسموم البوتولينوم العصبية لكل حالة تعريض.

حلل التكرار مقابل ضوابط مطابقة للعمر والدفعة، ثم حدد الدلالة الإحصائية لنسبة تثبيط النشاط التشابكي باستخدام الاختبارات الإحصائية المناسبة من اليوم السابع (div 7) إلى اليوم التاسع والأربعين (div 49)، حيث تعبر ESNs عن مقصورات ذات توجه عصبي وتكون ثقوباً تشابكية. واجهات شجيرية تصنيفية. تتعرض ESNs لتثبيط النشاط التشابكي عند تعرضها للنمط المصلي a TG من سم البوتولينوم العصبى وسم الكزاز.

جُمِعت هذه الآثار التمثيلية من الخلايا العصبية الحسية الجنينية (ESNs) بعد 20 ساعة من إضافة ذيفان البوتولينوم العصبي من النمط المصلي A، أو ذيفان الكزاز العصبي، أو المادة الحاملة إلى الحمام. أدى كل ذيفان عصبي إلى تقليل النشاط التشابكي بنسبة تزيد عن 95% مقارنة بمجموعات الضبط. وتوضح الصور الأربع التالية مدى حساسية استخدام mIST لقياس النشاط التشابكي أحادي المشبك في الخلايا العصبية الحسية الجنينية المعالجة بذيفان البوتولينوم العصبي من النمط المصلي A.

تُظهر هذه الصورة الأولى آثاراً تمثيلية من قياسات مفقودة للنشاط التشابكي بعد 20 ساعة من إضافة سم البوتولينوم العصبي من النمط المصلي A إلى الحمام. أظهرت مقاطع تتبع تثبيت الجهد انخفاضاً في تردد M-E-P-S-C بعد التعرض لسم البوتولينوم العصبي من النمط المصلي A. وتُظهر هذه الصورة التكميم الخاص بتردد M-E-P-S-C وتؤكد وجود انخفاض يعتمد على الجرعة في تردد M-E-P-S-C. تم تحديد التركيز التثبيطي المتوسط باستخدام ملاءمة المربعات الصغرى لانحدار غير خطي باستخدام منحدر متغير بأربعة معاملات. ملاحظة: حد الكشف بواسطة mist في SNS هو 0.005 picaMolar على الأقل.

يوضح هذا الرسم البياني الشريطي التكميم القياسي للتدفق الخلوي لانقسام SNAP 25 المقاس بواسطة لطخة وسترن. لاحظ انخفاض حساسية انقسام بروتين snare كقراءة للتسمم. وبالمقارنة مع mist، تشير النجمة الواحدة إلى قيمة P أقل من 0.05.

تشير النجمة الثلاثية إلى قيمة P أقل من 0.001. وتثبت هذه النتائج أن المجموعات الشبكية من الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية توفر نموذجاً خلوياً ذا صلة فسيولوجياً للتسمم بالسموم العصبية الكلوستريدية. ومن المتوقع أن يؤدي استخدام SNS إلى تقليل معاناة الحيوانات ونفوقها بشكل كبير من خلال العمل كبديل مناسب لاختبار الفتك في الفئران، مع ميزة إضافية تتمثل في تحسين السرعة والنوعية والحساسية.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم السموم العصبية لاستخدام تقنيات فحص متوسطة الإنتاجية تعتمد على نشاط الشبكة العصبية، وذلك لتسهيل الفحص العلاجي والكشف عن السموم العصبية المطثية.