وProteoliposome القائم على الدفق الفحص تحديد خصائص جزيء واحدة من الكلور ^- القنوات وأنظمة نقل

العام من هذا الإجراء هو التحديد الكمي لنشاط النقل لقنوات الكلوريد المعاد تشكيلها أو ناقلاتها. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعادة تشكيل الناقل النقي النقي أولا إلى جسيمات شحمية بكثافة منخفضة بحيث يحتوي كل جسيم شحمي إما على صفر أو نسخة واحدة من المركب النشط بعد إزالة أيونات الكلوريد الخارجية بحيث يكون هناك تدرج أيوني موجه للخارج ، تضاف الجسيمات الشحمية إلى غرفة التسجيل حيث يتم مراقبة تركيز الكلوريد باستخدام قطب حساس للكلوريد. بعد ذلك ، يبدأ كلوريد flx من الجسيمات الشحمية عن طريق إضافة Val Mycin ، وهو أيونوفور البوتاسيوم ، الذي يحافظ على إمكانات الغشاء.

بمجرد أن تصل الإشارة إلى حالة مستقرة ، يتم إنهاء التجربة بإضافة منظف لإذابة الجسيمات الشحمية. في النهاية ، من خلال قياس معدل تدفق الكلوريد من الجسيمات الشحمية البروتيا ، المعاد تكوينها بقناة أو ناقل منقى ، من الممكن تحديد معدل النقل الوحدوي وقياس متكافئ مركب البروتين النشط كميا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الأخرى الحالية ، مثل قياسات التدفق القائمة على التألق ، هي أنه باستخدام هذه التقنية ، من الممكن تحديد المعلمات الرئيسية للناقل المعاد تشكيله كميا ، مثل معدل الدوران الوحدوي ، وهندسة المجمع.

بالإضافة إلى توفير مقاييس كمية لهذه المعلمات الرئيسية ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد تأثير جزيئات الطفرة الصغيرة بسرعة ودقة ، ومراقبة الوحدات الفرعية في بروتين النقل المعاد تشكيله. يتكون إعداد التسجيل من غرفتين ، قطب كلوريد ، مقياس الأس الهيدروجيني مع إخراج كهربائي تناظري أو رقمي ، محول رقمي وجهاز كمبيوتر مزود ببرنامج اقتناء مناسب. قم بتوصيل قطب الكلوريد بمقياس الأس الهيدروجيني ، ثم قم بتوصيل خرج مقياس الأس الهيدروجيني بجهاز التحويل الرقمي المتصل بالكمبيوتر.

ضع القطب المرجعي في غرفة واحدة وسلك إعادة التشفير في الغرفة الأخرى. بعد ذلك ، ضع الغرف على طبق تقليب مع شريط التحريك في غرفة التسجيل. تأكد من أن شريط التحريك لا يلمس القطب.

قم بتوصيل الغرف باستخدام جسر أجار في الليلة السابقة للتجارب ، وقم بتورم جرام واحد من حبات cidex G 50 في 15 مل من المخزن المؤقت الخارجي مع رج لطيف لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. تتطلب كل تجربة ما يقرب من ثلاثة ملليلتر من الخرز المتورم بينما تذوب الجسيمات الشحمية في درجة حرارة الغرفة. صب ما يقرب من ثلاثة ملليلتر من حبات G 50 المنتفخة في كل عمود.

دعهم يجفوا بالجاذبية. يتدفق في درجة حرارة الغرفة. يستغرق هذا عادة من دقيقة إلى دقيقتين.

بعد ذلك ، قم بإعداد حويصلات أولولار عن طريق بثق الجسيمات الشحمية البروتيا 11 مرة من خلال آلة بثق صغيرة باستخدام قطع تفلون 0.4 ميكرون. ثم ضع العمود في جهاز طرد مركزي بلاستيكي دائري القاع لمدة 20 إلى 30 ثانية عند 1400 جم في جهاز طرد مركزي سريري لإزالة المحلول الزائد. بعد ذلك ، حراسة التدفق من خلال ، ضع العمود في أنبوب زجاجي 13 × 100 ملم وأضف 100 ميكرولتر من الحويصلات المبثوقة إلى العمود.

قم بتدوير العمود لمدة دقيقة واحدة عند 500 G.In جهاز طرد مركزي سريري ، واجمع ما يقرب من 200 ميكرولتر من التدفق الذي سيتم إضافته من خلاله إلى غرفة التسجيل. لإجراء قياس التدفق ، ضع ملليلترين من 100 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم في الغرفة المرجعية ، و 1.8 مل من المخزن المؤقت الخارجي لغرفة التسجيل. ابدأ برنامج الاستحواذ.

دع خط الأساس يتوازن. قد يستغرق هذا بضع دقائق. بمجرد أن تصل الإشارة إلى خط أساس ثابت ، ابدأ التسجيل.

أضف 15 ميكرولترا من محلول كلوريد البوتاسيوم المولار تان لمعايرة النظام. ثم أضف الجسيمات الشحمية. قد تكون قفزة صغيرة مرئية بسبب الإزالة غير الكاملة للكلوريد الخارجي من الجسيمات الشحمية البروتيا.

انتظر حتى يستقر خط الأساس. بعد ذلك ، أضف CIN لبدء flx. دع FLX يدير مساره الزمني حتى يستقر

في هذه المرحلة ، أضف 40 ميكرولترا من 1.5 مبيد جلوكوسيد بيتا ثماني المولار المحضر في المخزن المؤقت الخارجي لإذابة جميع الجسيمات الشحمية. ثم انتظر من 10 إلى 15 ثانية. قم بإنهاء التسجيل وانتقل إلى تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.

عندما يتم غمر الجسيمات الشحمية التي تحتوي على كلوريد داخلي مرتفع في كلوريد منخفض ينتج عنه تدرج كلوريد 300 ضعف ، لا يلاحظ أي تدفق أيوني صافي. وذلك لأن الجسيمات الشحمية الخالية من البروتين لها نفاذية جوهرية منخفضة للأيونات. لم يلاحظ أي FLX عياني من الجسيمات الشحمية البروتينية المعاد تشكيلها باستخدام ناقل الكلوريد المقترن بالبروتون ، C-L-C-E-C واحد.

نظرا لأن الكمية الصغيرة من الكلوريد الخارجة من فيسكو تبني شحنة موجبة صافية في الجسيم الشحمي ، فإن إضافة CIN تسمح لأيونات البوتاسيوم بالتحرك عبر الغشاء ، مما يخفف من الجهد الكهربائي ويبدأ كلوريد flx. يتم إنهاء التفاعل ويتم قياس الكمية الإجمالية لأيونات الكلوريد الموجودة في الحويصلات لتحديد خصائص البروتينات المفردة المعاد تكوينها. يتم تحويل البيانات الأولية للمسار الزمني للتدفق أولا من ملي فولت إلى تركيز كلوريد ثم يتم تطبيع الدورة الزمنية بعد ذلك.

تم تحديد أن ثابت الوقت للتدفق هو 41 ثانية وجزء الجسيمات الشحمية التي تحتوي على صفر نسخ نشطة من C-L-C-E-C واحد هو النقطة 31 ، مما يشير إلى أن ما يقرب من ثلث الجسيمات الشحمية لا تحتوي على أي بروتينات نشطة من هذه القيم وقياس محتوى الكلوريد في الحويصلات التي تحتوي على نسخة واحدة على الأقل من C-L-C-E-C واحد ، من الممكن تحديد معدل نقل موحد ل C-L-C-E-C واحد يساوي حوالي 2،500 أيونات كلوريد في الثانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الحاجة إلى دوران الناقل. يمكن إجراء هذه التجارب في غضون 10 إلى 15 دقيقة عند إجراؤها بعناية.

من الأهمية بمكان تقييم جودة الجسيمات الشحمية بعناية لأن التسريبات تؤثر سلبا على تقديرات معدل الدوران.