نماذج دورة حياة فيروس الايبولا تحت شروط السلامة الأحيائية المستوى 2 مع جزيئات تشبه الفيروسات يحتوي على Tetracistronic Minigenomes

الهدف العام من التجربة التالية هو نمذجة دورة حياة فيروس إيبولا شديد الإمراض تحت ظروف مستوى السلامة البيولوجية الثاني. ويتم تحقيق ذلك من خلال إنتاج جسيمات شبيهة بالفيروسات، والتي تمتلك نفس التركيب البروتيني لجسيمات فيروس إيبولا، ولكنها تحمل جينومًا مصغرًا بدلاً من الجينوم الفيروسي. والجينوم المصغر هو نسخة مصغرة من الجينوم الفيروسي حيث يتم إزالة الجينات الفيروسية واستبدالها بجين مراسل مثل luciferase.

ومن المهم الإشارة إلى أن الجينوم المصغر المستخدم في هذه التجربة لا يزال يحمل عدداً من الجينات الفيروسية، والتي تشفر البروتينات الفيروسية VP40 وGP-one two وVP24. ويتم إنتاج جسيمات شبيهة بالفيروسات عن طريق التعبير عن جينوم مصغر في خلايا 293T والتي تسمى الخلايا المنتجة، جنباً إلى جنب مع البروتينات الفيروسية np وVP35 وVP30 وL، والتي تسمى مجتمعة أيضاً بروتينات RNP.

يتم بعد ذلك تضاعف الجينوم المصغر ونسخه إلى mRNAs بواسطة البروتينات الفيروسية. وتُشفّر هذه الـ mRNAs المراسل Luciferase والبروتينات الفيروسية الإضافية VP40 وGP-one two وVP24. وتؤدي هذه البروتينات الثلاثة مجتمعة إلى إنتاج جسيمات شبيهة بالفيروسات، والتي تُسمى الجسيمات الشبيهة بالفيروسات القادرة على النسخ والتضاعف أو TRVLPs، وذلك لأن القفيصات النووية الموجودة فيها قادرة على الخضوع لتضاعف الجينوم والنسخ. وبما أن TLPs تحمل البروتين السكري GP-one two لفيروس إيبولا، فإنها تكون قادرة على إصابة الخلايا المستهدفة.

تم نقل بلازميد التعبير الخاص بـ np وVP35 وVP30 وL مسبقاً إلى هذه الخلايا المستهدفة. وتعمل بروتينات RNP هذه معاً على التعرف على الجينوم المصغر الذي تم إدخاله إلى الخلايا المستهدفة داخل TRVLPs. بعد ذلك، يتم تكرار الجينوم المصغر ونسخه، مما يؤدي إلى نشاط البروتين المراسل، بالإضافة إلى إنتاج TRVLPs جديدة، والتي يمكن استخدامها مرة أخرى لإصابة خلايا مستهدفة جديدة.

ومن المهم الإشارة إلى أن الجينوم المصغر لا يحمل المعلومات الوراثية اللازمة لتضاعفه؛ وبناءً على ذلك، لا يمكن لـ TRVLPs أن تصيب الخلايا التي لا تعبر عن بروتينات RNP الأربعة بشكل فعال. وهذا ما يجعل النظام آمناً للاستخدام في ظل ظروف المستوى الثاني من السلامة البيولوجية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في أنها تتيح لنا نمذجة دورة حياة الفيروس الكاملة، بما في ذلك تضاعف الجينوم، والتعبير عن نواتج الجينات الفيروسية، وإنتاج الجسيمات الفيروسية، وإصابة الخلايا المستهدفة عبر دورات متعددة من عوامل الحقن تحت ظروف المستوى الثاني من السلامة البيولوجية. وهذا يعني إمكانية إجراء هذا العمل دون الحاجة إلى مختبر احتواء أقصى، وهو الأمر الذي يكون مطلوباً بخلاف ذلك للعمل مع فيروسات الإيبولا الحية. يمكن دمج هذه الطريقة مع تقنيات أخرى مثل تثبيط العوامل الخلوية بوساطة RNA أو الإفراط في التعبير عن تلك العوامل لدراسة دور هذه العوامل في بيولوجيا الفيروس. كما يمكننا إدخال طفرات في الجينات الفيروسية لدراسة دور هذه الجينات ونواتجها الجينية في بيولوجيا الفيروس.

قم بفصل الخلايا عن طريق إزالة الوسط من خلايا 293T التي وصلت نسبة تلاقيها إلى 80 إلى 90%، وغسلها مرتين باستخدام PBS، ثم إضافة 2 mL من التربسين إلى الخلايا. انتظر حتى تصبح الخلايا مستديرة.

بعد ذلك، قم بفصل الخلايا عن طريق النقر على القارورة وإضافة 8 mL من الوسط الغذائي المحتوي على 10%FBS إلى الخلايا. قم بعد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي، ثم خفف الخلايا لتصل إلى 2 × 10⁵ خلية لكل milliliter، وزرع 2 mL في كل بئر من أطباق الزرع ذات الستة آبار. أعد الخلايا إلى حضانة مرطبة عند درجة حرارة 37 °C مع 5%CO2. بعد مرور 24 ساعة، قم بنقل البلازميدات المطلوبة لإنتاج TRVLPs إلى الخلايا. في كبينة السلامة البيولوجية (BSC)، انقل الحمض النووي DNA إلى أنبوب باستخدام رؤوس ماصات مزودة بمرشحات. كعينة ضابطة سلبية في أحد الآبار، يجب استبعاد البلازميد الذي يشفر بوليميراز الفيروس L، وبدلاً من ذلك، يمكن نقل بلازميد يشفر GFP لتصور كفاءة عملية النقل. ثم أضف 100 µL من optimum لكل بئر إلى DNA. قم برج الأنبوب باستخدام جهاز vortext ثم قم بتدويره في جهاز الطرد المركزي لترسيب المحتويات.

بعد ذلك، أضف 7.5 µL من كاشف عفن الخلايا transIT LT-one إلى الحمض النووي المخفف. قم برج الأنبوب بلطف باستخدام جهاز الرج (vortex) واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وبعد مرور 15 دقيقة، امزج خليط عفن الخلايا بلطف عن طريق السحب والطرد باستخدام الماصة، ثم أضف 100 µL من الخليط إلى كل بئر من آبار طبق سداسي الآبار على شكل قطرات.

بمجرد إضافة معقدات عفن التعداء (transfection complexes) إلى الخلايا، قم بهز الطبق للأمام والخلف ومن جانب إلى آخر. تجنب تدوير الطبق لأن ذلك سيؤدي إلى عملية عفن تعداء غير متساوية. بعد ذلك، أعد الخلايا إلى الحاضنة. وبعد مرور 24 ساعة على عملية عفن التعداء، قم بإزالة السائل الطافي من الخلايا. ثم أضف أربعة ملليلتر من الوسط الغذائي مع 5%FBS إلى الخلايا وأعدها إلى الحاضنة.

بعد مرور 24 ساعة من ترانسفكشن الخلايا المنتجة، قم بتجزئة خلايا 293T كما تم وصفه سابقاً. وبعد 24 ساعة من التجزئة، قم بعمل ترانسفكشن لها باستخدام البلازميدات التي تشفر بروتينات RNP لفيروس Ebola، بالإضافة إلى Tim-one، الذي يعمل كعامل التصاق لفيروسات Ebola. وبعد 72 ساعة من ترانسفكشن الخلايا المنتجة و24 ساعة من ترانسفكشن الخلايا المستهدفة، قم بجمع السائل الطافي من الخلايا المنتجة ونقله باستخدام الماصة إلى أنبوب سعة 15 milliliter.

بعد جمع السائل الطافي، قم بإزالة أي سائل متبقٍ وأضف 250 µL من محلول التحلل المتوهج (glow lysis buffer) إلى الخلايا واحضنها لمدة 10 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتحديد نشاط لوسيفيراز (luciferase activity) كما هو موضح في الخطوة الثالثة من هذا الفيديو. في هذه الأثناء، قم بطرد السائل الطافي من الخلايا المنتجة مركزياً لمدة خمس دقائق عند 800 g وفي درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط من الخلايا المستهدفة وأضف 3 mL من السائل الطافي المصفى من خلايا P-zero إلى الخلايا المستهدفة. قم بتنفيذ هذه الخطوة في كل بئر على حدة. عند الانتهاء، أعد الخلايا المستهدفة إلى الحاضنة. 24 ساعة بعد العدوى.

قم بإزالة الطافي من الخلايا المستهدفة. بعد ذلك، أضف أربعة ملليلتر من الوسط الذي يحتوي على 5%FBS إلى الخلايا وأعدها إلى الحاضنة. ولتحديد نشاط المراسل في الخلايا المنتجة أو المستهدفة، يتم حصاد هذه الخلايا بعد 72 ساعة من عملية عفن الخلية في حالة الخلايا المنتجة، وبعد 72 ساعة من الإصابة في حالة الخلايا المستهدفة.

للقيام بذلك، قم بإزالة السائل الطافي من الخلايا وأضف 250 µL من محلول التحلل المتوهج (glow lysis buffer) إلى الخلايا واحضنها لمدة 10 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. وإذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام السائل الطافي لإصابة مجموعة جديدة من الخلايا المستهدفة؛ وفي هذه الحالة، قم بجمع السائل الطافي وإصابة الخلايا المستهدفة كما هو موضح في الخطوة الثانية من هذا الفيديو.

في هذه الأثناء، قم بإذابة 40 µL لكل بئر من منظم مقايسة اللوسيفيراز (luciferase assay buffer)، وأضف جزءاً واحداً من مادة ركيزة اللوسيفيراز (luciferase substrate) لكل 100 جزء من حجم المنظم. قم برج كاشف اللوسيفيراز النهائي باستخدام جهاز الفورتكس، وتأكد من وصوله إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة. بعد ذلك، انقل 40 µL من الكاشف بواسطة الماصة إلى طبق أبيض معتم يحتوي على 96 بئراً. ولتجنب حدوث تداخل في الإشارات (crosstalk)، يُنصح بترك بئر واحد فارغاً بين آبار العينات. بعد انتهاء فترة الحضانة التي تستغرق 10 دقائق، قم بغسل الخلايا في منظم التحلل (lysis buffer) عن طريق السحب بالماصة، ثم انقل ناتج تحلل الخلايا إلى أنبوب. قم بطرد نواتج التحلل مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 10,000 g وفي درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، انقل 40 µL من نواتج التحلل بواسطة الماصة إلى طبق الـ 96 بئراً الذي يحتوي على كاشف اللوسيفيراز. احضن العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد مرور الـ 10 دقائق، قم بقياس نشاط اللوسيفيراز باستخدام مقياس اللمعان (luminometer). يجب أن يكون زمن التكامل لقياس اللمعان ثانية واحدة. وباستخدام مقياس لمعان للأطباق الدقيقة من نوع modulus، يجب أن تكون إشارات اللمعان النموذجية للضابط الموجب حوالي 1×10⁶ إلى 1×10⁷، بينما يجب أن تكون إشارة الضابط السالب أقل بمقدار لوغاريتمين إلى ثلاثة على الأقل. وفي الممرات اللاحقة، يجب أن يظل نشاط المراسل في الضوابط الموجبة مستقراً، بينما ينخفض نشاط المراسل في الضوابط السالبة إلى مستويات الخلفية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على إنتاج جسيمات شبيهة بالفيروس تكون قادرة على تضاعف ونسخ فيروس Ebola، واستخدامها لإصابة الخلايا المستهدفة وقياس نشاط المراسل في كل من الخلايا المنتجة والخلايا المستهدفة.

من المهم الإشارة إلى أنه يمكن دمج هذه الطريقة مع تقنيات أخرى، مثل تثبيط العوامل الخلوية بوساطة RNA، وذلك لدراسة دور هذه العوامل في بيولوجيا الفيروس. كما يمكن إدخال طفرات في المكونات الفيروسية المستخدمة في هذه الطريقة من أجل دراسة دور هذه المكونات في دورة حياة فيروس Ebola. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل التجريبية والكواشف المحددة في المخطوطة المرفقة بهذا الفيديو.