بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجانس شظايا الأنسجة البشرية بسرعة في معلق خلية واحدة دون هضم إنزيمي للتحليل النوعي والكمي وعزل مجموعات سكانية فرعية معينة للخلايا الليمفاوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخدام مشرط معقم أولا لتقطيع شظايا الأنسجة إلى قطع صغيرة. بعد ذلك ، يتم نقل ملاط الأنسجة إلى أنبوب ميكانيكي منفصل حيث يتم تجانس الشظايا بشكل أكبر في تعليق خلية واحدة.

ثم يتم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لتحليلها في اتجاه مجرى النهر. في النهاية ، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل الخلايا الليمفاوية المتسللة ، والمجموعات السكانية الفرعية الآسيوية. طور مختبري هذه التقنية لأننا كنا نبحث عن طريقة يمكننا من خلالها تصوير الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم دون التأثير بشكل كبير على حالتها الأصلية.

أردنا شيئا يمكننا من خلاله عزل الخلايا بسرعة وتحليلها كما كانت في الجراحة. تم استخدام هذه التقنية على أكثر من 300 ورم في الثدي والأنسجة الطبيعية في مختبرنا ، وهي سهلة الاستخدام ويمكن استخدامها بشكل يومي. يمكن استخدامه لفحص علامات الإنذار والاستجابة للعلاج والنتائج السريرية طويلة المدى.

سيظهر هذه التقنية اليوم جون نيكولا لويك. فني في مختبري ابدأ بوزن عينة الأنسجة ثم قياس طول الأنسجة وعرضها وارتفاعها. ثم انقل جزء الأنسجة إلى طبق بتري صغير يحتوي على مليلتر واحد من وسط الخلايا المكونة للدم الخالي من المصل المناسب والمحدد كيميائيا ، واستخدم مشرطا معقما لتقطيع العينات إلى قطع صغيرة من واحد إلى ملليمترين مربعين.

بعد ذلك ، انقل محتويات الطبق إلى أنبوب C للتفكك الميكانيكي واشطف الطبق والمشرط بملليلترين من المتوسط. أضف الغسيل إلى الأنبوب C ثم قم بتشغيل برنامج التفكك الميكانيكي 0.01 مرتين متتاليتين لتجانس شظايا الأنسجة برفق في معلق خلية واحدة. بعد الدورة الثانية ، صب الجانس من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ثم استخدم نفس الآفة التي تحملها الماصة من غسل طبق بتري لنقل أي سائل متبقي في الأنبوب C إلى مصفاة الخلية. بعد ذلك ، استخدم ماصة صغيرة سعة مليلتر واحد لنقل السائل المصفى إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وشطف الأنبوب C بثلاثة ملليلتر إضافي من المتوسط. انقل هذا الغسيل من خلال مصفاة الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل.

ثم حرك الأنسجة غير المتجانسة برفق حول المصفاة بطرف نظيف واحد مليلتر للضغط على أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي المحاصر في الأنسجة في أنبوب 50 ملليلترا. الآن ، ضع مصفاة الخلية رأسا على عقب فوق الأنبوب C الأصلي واشطف المصفاة بثلاثة ملليلتر أخرى من الوسط حتى تسقط الأنسجة غير المتجانسة مرة أخرى في الأنبوب C. أعد تجانس الأنسجة لدورتين أخريين كما هو موضح للتو ، ثم صب هذا التجانس الثاني من خلال مصفاة الخلية.

مرة أخرى ، اشطف الأنبوب C بثلاثة ملليلتر أخرى من المتوسط. ثم قم بتصفية المادة الطافية من خلال المصفاة واضغط على السائل المتبقي من الأنسجة كما هو موضح للتو. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون هناك حجم يبلغ حوالي 2.5 مل من تعليق الخلية المفردة في أنبوب 15 مليلتر ، ويجب ملاحظة ما يقرب من تسعة ملليلتر في أنبوب 50 ملليلترا.

لفصل المادة الطافية للأنسجة عن أجهزة الطرد المركزي الأولى للخلايا ، يقوم كلا الأنبوبين المتجانسين لمدة 15 دقيقة عند 600 جي ودرجة حرارة الغرفة ، بصب المادة الطافية من أنبوب 15 مليلتر إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر ، ووضعها عند أربع درجات مئوية والتخلص من المادة الطافية من أنبوب 50 ملليلترا. ثم اضغط برفق على كل أنبوب على سطح صلب لتفتيت كل حبيبات من الكريات الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلية السائبة في 50 أنبوب مليلتر مع 500 ميكرولتر من المتوسط, ونقل الخلايا إلى 15 أنبوب مليلتر لإعادة تعليق الحبيبات الثانية.

ثم اشطف الأنبوب سعة 50 مليلتر ب 500 ميكرولتر أخرى من الوسط وانقل الغسيل إلى أنبوب سعة 15 مليلتر لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلايا. بعد عد عدد الخلايا القابلة للحياة بواسطة تريان أزرق استبعاد بيليه تعليق الخلية. أخيرا ، قم بتدوير المادة الطاففية للأنسجة المحفوظة.

ثم انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب نظيف واحد على الأقل دون لمس الحبيبات أو إزعاجها وتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية لتحليلها في المستقبل. في هذه الرسوم البيانية ، يتم عرض مخططات نقطية لقياس التدفق الخلوي التمثيلي لمجانسات الخلايا السرطانية المنفصلة ، متبوعة بوضع العلامات بأجسام مضادة محددة ضد الكريات البيض وعلامات الخلايا الظهارية كما هو موضح. لا يغير هذا البروتوكول بشكل كبير قابلية الخلايا الإيجابية CD 45.

ومع ذلك ، هناك خسارة كبيرة في الخلايا الإيجابية EPAM القابلة للحياة. على الرغم من هذا القابل للحياة ، يمكن فصل المجموعات الفرعية الإيجابية ل EPAM و CD 45 الإيجابية على أساس حجمها وهيكلها إلى خلايا سرطانية ظهارية كبيرة أو خلايا ظهارية صغيرة أو خلايا موجبة كبيرة وصغيرة CD 45. يتم عرض مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية للمجموعات الفرعية الرئيسية التي تتسلل إلى الورم هنا مع الخلايا الليمفاوية المسورة على صلاحية الخلايا الإيجابية CD 45.

أخيرا ، يمكن مقارنة تعبير السيتوكين أو الغلوبولين المناعي الكلي الموجود في الطافي الطافي لسرطان الثدي مع المادة الطافية من أنسجة الثدي الطبيعية التي تكشف كما هو موضح في هذه التجربة التمثيلية ، زيادات في كلا النوعين من البروتينات المرتبطة بأنسجة الورم أثناء إجراء الحضور ، من المهم أن تتذكر العمل بسرعة وتنظيف واستعادة أكبر قدر ممكن من المواد في كل خطوة من خطوات الإجراء للحصول على عدد كاف من الخلايا ل تحليل نقطة النهاية الخاصة بك.