الترسيب التوازن من البروتين غشاء صغير قليل وحدات تشكيل: تأثير الحامض الأميني إضافة بروتون على Pentameric الاستقرار

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد حجم oligo المتكون من عديد ببتيد صغير كاره للماء في منظف السلفالان C 14 واستقرار هذا الأولير عند تغيير الأس الهيدروجيني. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق تحديد تركيز أكسيد الديوتيريوم الذي يتطابق مع كثافة المنظفات في خلاياي ، وبالتالي يحيد طفوها. كخطوة ثانية ، تم إذابة مجموعة من تجارب توازن الترسيب لعينات البروتين الصغيرة الكارهة للماء.

في C 14 يتم تشغيل منظف السلفالين بتركيز أكسيد الردع المحدد. بعد ذلك ، يتم تكرار الخطوتين الأولى والثانية عند درجة حموضة مختلفة من أجل مقارنة ملف تعريف ترسيب البروتين عند قيم الأس الهيدروجيني المختلفة هذه. ستظهر النتائج كلا من حجم قليل القلة للبروتين الصغير الكارهة للماء في هذا المنظف وتأثير الأس الهيدروجيني على استقرار هذا oligo في منظف الفاصوليا C 14 sulf.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن العديد من الخطوات المتضمنة مثل تجميع وتحميل مطابقة كثافة الخلايا والوصول إلى ظروف التوازن ، وهذا يمكن أن يطغى بسهولة على المستخدمين لأول مرة ويربكهم. يمكن أن يؤدي أي خطأ صغير في هذه الخطوات إلى إضاعة عدة أيام من الوقت التجريبي. سيتم عرض الإجراء من قبل سوريا ، طالبة دكتوراه في مختبري.

أولا ، قم بإعداد 10 × عازلة و 50 × منظف. تقوم محاليل المخزون والفلتر بتعقيم كل منها من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر إلى 1.5 ملليلتر من محلول مخزون المنظفات 10 × و 50 ×. تحضير 200 ميكرولتر من ثلاثة محاليل عينات منفصلة تحتوي على 10٪ 30٪ و 50٪ أكسيد الديوتيريوم من حيث الحجم.

لتجميع خلية التحليل الفائق سداسية القنوات بدون تعبئة خارجية ، ضع حشية النافذة في حامل النافذة ، وثني بطانة النافذة قليلا وضعها في حامل النافذة بحيث تتشكل الفجوة مقابل حامل النافذة. ثم ضع Keyway نافذة من الياقوت داخل بطانة النافذة ، وقم بمحاذاة العلامة مع حامل النافذة. Keyway مكان لبيع المساكن برقم جزء مقلوب مع الممرات الرئيسية بما يتماشى مع مفتاح الإسكان.

حرك قطعة مركزية من ستة قطاعات مع جانب مشطوف لأسفل في مبيت الخلية متبوعا بمجموعة نافذة واحدة مع نافذة متجهة لأسفل بعد ذلك قم بتغطية خيوط الحلقة اللولبية برفق وغسالة الحلقة اللولبية بمواد تشحيم معطف تدور. ضع غسالة حلقة لولبية أعلى مجموعة النافذة. قم بتثبيت الحلقة اللولبية في مبيت النافذة بحيث تكون الكلمة متجهة للخارج ، وشد الحلقة اللولبية باستخدام أداة محاذاة الخلية.

ثم شد الحلقة اللولبية إلى 60 بوصة فقط باستخدام مفتاح عزم الدوران. بعد ذلك ، ضع خلية برقم الجزء في وضع مستقيم ووضعها في الساعة 12 ظهرا. قم بتحميل 120 ميكرولترا من المحلول المرجعي في الصفوف اليسرى و 110 ميكرولتر من محلول العينة في الصفوف اليمنى.

استخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر لضمان إقران كل عينة ومرجع بشكل صحيح بعناية. حرك مجموعة نافذة واحدة بحيث تكون النافذة متجهة لأسفل إلى مبيت الخلية ، مع الحرص على عدم إزعاج الخلية بشكل مفرط لأن ذلك قد ينسكب محتوياتها. كرر الخطوات السابقة ، وشد الحلقة اللولبية الثانية إلى 120 بوصة رطلا.

ثم اقلب الخلية وأعد شد الحلقة اللولبية الأولى إلى 120 بوصة رطلا. قم بتحميل الخلايا في الدوار. قم بتثبيت الدوار في جهاز الطرد المركزي ، وقم بتثبيت أحادي اللون وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

بعد الوصول إلى فراغ كاف ، قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي بسرعة 3000 دورة في الدقيقة. قم بمعاينة نمط التداخل في برنامج واجهة المستخدم واضبط معلمات الليزر للحصول على أعلى تباين. بعد ذلك ، قم بإنشاء ملف إعداد جديد ، مع تحديد قياس التوازن والتداخل.

قم بإعداد طريقة توازن الترسيب لتعمل بسرعة 45،000 دورة في الدقيقة أو أعلى سرعة متوقعة لعينات البروتين بدرجة حرارة تشغيل عند 20 درجة مئوية بعد جمع واحدة ، قم بالمسح الضوئي كل 15 دقيقة لمدة 12 ساعة على الأقل. راقب تقدم التوازن عن طريق فتح ملفات البيانات في التحليل غير المتجانس وتحديد وظيفة المطابقة. في هذه المرحلة ، قم بتجميع خلية طرد مركزي تحليلية سداسية القنوات مع نوافذ كوارتز بنفس الطريقة كما كان من قبل.

باستخدام أطراف تحميل الهلام ، قم بتحميل عينة البروتين الصغيرة الكارهة للماء المعدة مسبقا في القناة الأقرب إلى مركز الدوار ، وعينة أقل تركيز أبعد عن مركز الدوار. لإعداد قياس الامتصاص، قم بإنشاء ملف إعداد جديد يحدد قياس التوازن والامتصاص. حدد 280 نانومتر كطول موجي للكاشف.

بعد ذلك ، قم بإجراء معايرة شعاعية عند 3000 دورة في الدقيقة عن طريق التحقق من المعايرة الشعاعية قبل خيارات المسح والمسح الأول. تحديد جمع البيانات بدقة منخفضة وتنفيذ فحص واحد. بعد اكتمال الفحص ، قم بإلغاء تحديد الخيار.

قم بإعداد طريقة توازن الترسيب للتشغيل بالسرعة الأولى المحسوبة مسبقا عند 20 درجة مئوية وجمع مسح واحد كل 30 دقيقة في تفاصيل كل خلية. حدد جمع البيانات بدقة منخفضة بعد 18 ساعة على الأقل. راقب تقدم التوازن عن طريق فتح ملفات البيانات في التحليل غير المتجانس وتحديد وظيفة المطابقة بمجرد الوصول إلى التوازن.

اجمع مسحا واحدا بدقة عالية بعد اكتمال الفحص. كرر الخطوات السابقة للسرعة التالية عندما يكون الوقت اللازم للوصول إلى التوازن لكل سرعة معروفا. قم بإعداد طريقة توازن الترسيب المسح الضوئي لتشمل جميع السرعات المحسوبة مسبقا ولجمع مسح ضوئي واحد بعد وقت التوازن لكل سرعة.

في هذه الحالة ، حدد جمع البيانات عالية الدقة في تفاصيل كل خلية ، والتوزيع الشعاعي لمنظف C 14 Sultan لخلاياي ، و 50 مولار. يشكل الرقم الهيدروجيني 7.3 أسيا ضحلا جدا يمكن تركيبه على نموذج خطي. يعتمد ميل هذا الملف الشخصي على تركيز أكسيد الديوتيريوم ووجد أن التركيز الذي أنتج منحدر صفري هو 32.3٪ تم تكرار نفس التجربة لدرجة الحموضة 5.5 ودرجة الحموضة ثلاثة للحصول على تركيزات أكسيد الديوتيريوم المطابقة 30.3٪ و 41٪ على التوالي.

عند الرقم الهيدروجيني 7.3 ، وجد أن البروتين والمنظفات الصغيرة الكارهة للماء تشكل خماسيات ذات لوغاريتم واضح لثابت التقارب 21.05. لم يتغير ثابت الارتباط عند الرقم الهيدروجيني 5.5 ، ولكن تم انخفاضه بشكل ملحوظ عند الرقم الهيدروجيني ثلاثة. يتوافق هذا مع التقارير السابقة التي تظهر انخفاضا في الموصلية عند درجة الحموضة المنخفضة مع PK يبلغ حوالي 4.5.

بمجرد إتقان تجميع خلية التوازن ، يمكن إجراء التحميل وإعداد التجربة في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على الحصول على فهم جيد لكيفية إعداد تجربة توازن الترسيب حتى تتمكن من تحديد الحجم الأولي-ماتيك لبروتين الغشاء الخاص بك وأيضا لمقارنة الاستقرار وظروفها التجريبية المختلفة.