مقاربة Optogenetic لتقييم تشكيل الوصلات العصبية في نظام المشارك الثقافة

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء نظام استزراع مشترك لتقييم قدرة العصبونات المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات على تكوين اتصالات وظيفية باستخدام نهج جيني يعتمد على التحفيز الضوئي للعصبونات المستزرعة عبر القناة RUSIN two أو CR two. ويتم تحقيق ذلك من خلال عزل الخلايا السلفية العصبية الأولية للفئران أو NPCs أولاً، والسماح لها بالتمايز إلى خلايا نجمية. بعد ذلك، يتم ترنسفكشن العصبونات القشرية الأولية للجرذان بـ CH R two وزراعتها فوق طبقة الخلايا النجمية، والتي تعمل كجمهرة عصبونية موجودة.

بعد ذلك، يتم نقل فيروس synapsin one 2D tomato إلى الخلايا السلفية العصبية البشرية (NPCs) المشتقة من مزارع الخلايا الجذعية المستحثة وافرة القدرة (iPSC)، ثم يتم وضعها فوق مزرعة الخلايا النجمية والعصبية وتحفيزها للتمايز، مما يؤدي لاحقاً إلى تكوين اتصالات مشبكية. وتظهر النتائج أن العصبونات المشتقة من iPSC تكوّن اتصالات مشبكية مع العصبونات القشرية للجرذ، وذلك استناداً إلى التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية للتيارات بعد المشبكية في العصبونات المشتقة من iPSC عند التحفيز الضوئي الجيني للعصبونات القشرية التي تعبر عن CHR2. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالطرق الحالية، مثل تلك التي تعتمد على الزراعة المشتركة للخلايا النجمية فقط مع العصبونات البشرية المشتقة من iPSC، في أن وقت نضج هذه العصبونات البشرية يكون أقصر.

يرجع ذلك إلى أن وجود العصبونات الأولية يمكن أن يسرع من نضج هذه العصبونات البشرية. سيقوم بتوضيح الإجراء كل من Uni Chin، وهو طالب دراسات عليا من مختبري، وsuing Y من مختبر George Augustine. بعد حصاد أدمغة الجرذان الجنينية وعزل النسيج القشري وفقاً للبروتوكول النصي، انقل الأنسجة القشرية إلى طبق يحتوي على محلول هضم الأنسجة القشرية الذي تم تسخينه مسبقاً. قم بتقطيع الأنسجة القشرية إلى قطع صغيرة قدر الإمكان قبل تحضينها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. بعد التحضين، انقل الأنسجة القشرية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL، ثم قم بتفكيك الأنسجة باستخدام ماصة سيرولوجية حتى يتم الحصول على محلول متجانس خالٍ من قطع الأنسجة.

مرر محلول الأنسجة عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 micron لتصفية أي تكتلات نسيجية متبقية. وزع ثلاث milliliters من المحلول في أنابيب طرد مركزي سعة 15 milliliters.

أضف 800 microliters من 7.5%BSA في one XPBS إلى قاع كل أنبوب، لتكوين طبقة أسفل طبقة النسيج، ثم قم بالطرد المركزي عند 200 Gs لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة الطافي عن طريق السحب من السطح الفاصل بين الطبقتين. تجنب تعكير راسب selp الموجود في قاع الأنبوب.

بعد استخدام 1 mL من وسط الخلايا العصبونية الأولية لإعادة تعليق كل كتلة خلوية، اجمعها جميعاً في أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL. ثم استخدم مقياس كرات الدم (hemocytometer) لتحديد الكثافة الخلوية. قم بطرد 6 مليون من الخلايا العصبونية القشرية للجرذان مركزياً عند 200 ×g لمدة خمس دقائق، ثم تخلص من الطافي.

يلزم توفر 6 مليون خلية عصبية قشرية على الأقل لعملية التثقيب الكهربائي. ولضمان تكوين شبكة عصبية بواسطة الخلايا العصبية الناجية، أضف 100 µL من محلول التثقيب الكهربائي إلى كتلة الخلايا وأعد تعليقها بلطف. بعد ذلك، امزج 100 µL من معلق الخلايا مع 6 µg من بلازميد CR two وانقل المزيج إلى وعاء معتمد.

اختر وطبق برنامج التثقيب الكهربائي المناسب وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد التثقيب الكهربائي، أضف 500 µL من MEM إلى الوعاء. انقل الخلايا إلى 11.5 mL من وسط العصبونات الأولي، ثم أعد تعليقها برفق.

ثم أضف 500 µL في كل بئر من أطباق ذات 24 بئراً تحتوي على خلايا نجمية فئرانية. قم بتحضين الطبق عند 37 °C و5%CO2. بعد توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (IPCs)، قم بتحفيز الخلايا والحفاظ عليها كمزرعة خلايا عصبية سلفية بشرية (NPC) وفقاً للبروتوكول النصي.

في هذا المثال، يتم وسم الخلايا السلفية العصبية (NPCs) باستخدام الناقل lentiviral synapse in one TD tomato في اليوم التالي لإضافة العصبونات الأولية إلى مزرعة الخلايا النجمية. استخدم one XPBS لغسل الخلايا السلفية العصبية البشرية مرة واحدة، ثم أضف محلول فصل الخلايا وحضنها لمدة خمس دقائق عند 30 °C. تأكد من انفصال جميع الخلايا.

بعد ذلك، انقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على ضعف كمية D-M-E-M-F 12، ثم قم بالطرد المركزي عند 200 G لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي واستخدم وسط التمايز العصبي لإعادة تعليق الراسب برفق إلى خلايا مفردة. استخدم مقياس كرات الدم (hemocytometer) لعد الخلايا.

بعد ذلك، اسحب الوسط بعناية من طبق مزارع الخلايا العصبية القشرية والخلايا النجمية. أضف الخلايا السلفية العصبية البشرية (NPCs) بكثافة 5,000 خلية لكل سنتيمتر مربع لكل بئر في وسط التمايز العصبي. قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية و5%CO2، واستبدل الوسط كل يومين أو ثلاثة أيام لمدة 28 يوماً على الأقل.

للتأكد مما إذا كانت الخلايا السلفية العصبية البشرية (human IPCs) تسلك سلوك العصبونات الناضجة، استخدم مجهراً بؤرياً (confocal microscope) مجهزاً بعدسة غمر مائية 60 x للعثور على الخلايا المتمايزة من الـ human IPCs. ومن خلال تصور TD tomato، قم بسحب ماصة تسجيل حتى تصل المقاومة إلى 4 إلى 6 ohm perfuse.

تُحفظ الخلايا في درجة حرارة الغرفة في محلول خارجي يتم فقعه باستمرار بـ 95% oxygen و 5% carbon dioxide. يُستخدم محلول داخلي لملء الماصة الدقيقة للتسجيل، ثم يتم تثبيت قطعة (patch) من خلية طماطم TD موجبة في وضع الخلية الكاملة (whole cell mode)، وتسجيل إطلاق جهد الفعل استجابةً لحقن التيار في مثبت التيار (current clamp). وذلك للتأكيد على أن جهد الفعل للخلايا القشرية التي تعبر عن CHR two يتم استحثاثه بشكل موثوق عن طريق التحفيز الضوئي.

أولاً، حدد الخلايا القشرية التي تعبر عن CR two من خلال تصور GFP عبر الإضاءة الضوئية بمصباح قوس الزئبق، وباستخدام مرشح طول موجة الإثارة 480 over 40 nanometers. تحقق من استحثاث جهد الفعل بشكل موثوق عبر تسجيل تثبيت التيار (current clamp) في وضع الخلية الكاملة. لإجراء التحفيز الجيني، قم بتثبيت خلية موجبة لـ TD tomato في وضع الخلية الكاملة واضبط تثبيت الجهد (voltage clamp) عند negative 70 millivolts باستخدام مصباح الزئبق للمجال الكامل ومرشح إثارة 480 over 40.

قم بتحفيز المجال بأكمله لمدة 30 ثانية. سجل التيارات بعد المشبكية أو PSCs لخلية تم تثبيتها بـ patch، والمستحثة عن طريق التحفيز الضوئي للعصبونات القشرية قبل المشبكية التي تعبر عن CHR two. اضبط عتبة السعة ومساحة التيارات عند 5 pA و 5 pC على التوالي، ثم افحص هذه الأحداث يدويًا لاستبعاد أي آثار ليست PSCs.

كما هو موضح في هذا الفيديو، يتطلب توليد المزرعة المشتركة من العصبونات المشتقة من IPCs والعصبونات القشرية الأولية والخلايا النجمية عدة خطوات. تظهر هذه الصورة أنه في اليوم الثاني من تمايز NPCs الفأرية إلى خلايا نجمية، يمكن ملاحظة الخلايا النجمية الموجبة للبروتين الحمضي الليفي الدبقي أو GFAP بسهولة. سُمح لـ NPCs الفأرية بالتمايز لمدة أسبوع على الأقل قبل زراعة العصبونات القشرية التي تعبر عن CR two فوق الطبقة أحادية الخلايا النجمية، ويتم تحديد كليهما في هذه المزرعة المشتركة من خلال صبغ التألق المناعي لـ GFAP و CHR two.

بعد مرور ثلاثة إلى أربعة أسابيع من تمايز الخلايا السلفية العصبية (NPC) البشرية، تم الكشف عن العصبونات الموجبة لـ TD tomato في المزارع كما هو موضح هنا. وعند التحفيز بالضوء، تولدت جهود فعل في العصبونات القشرية التي تعبر عن CHR two IPSC. كما أن العصبونات المشتقة قابلة للاستثارة، حيث أظهرت زيادة في النشاط.

حدث جهد فعل محتمل مع زيادة سعة نبضات تيار إزالة الاستقطاب. وفي غياب الضوء، استقبلت العصبونات المشتقة من IPSC مدخلات مشبكية تلقائية. وكانت هذه التيارات بعد المشبكية الداخلة تتوسطها بشكل أساسي مستقبلات AMPA.

استمر التحفيز الضوئي للعصبونات القشرية طوال الومضة الضوئية الطويلة الثانية والثلاثين بينما ارتفع تردد تيارات ما بعد التشابك (PSCs). وعندما تم تحفيز العصبونات القشرية التي تعبر عن CHR two ضوئياً، لم تتأثر سعتها. وعقب هذا الإجراء، يمكننا استخدام أنظمة زراعة مشتركة أخرى مع أنواع مختلفة من الخلايا الخاصة بالمرضى للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تأثير مركبات الأدوية المرشحة على أمراض محددة ذات أهمية.