نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج كميات كبيرة من فيروس الأنفلونزا عالي العيار ، في نظام فعال من حيث التكلفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحصول أولا على بيض دجاج مخصب طازج وخالي من مسببات الأمراض في الدم. في الخطوة الثانية ، يصاب البيض بفيروس الأنفلونزا عبر جذر آلان تويك.

لمدة 48 ساعة ، يتم بعد ذلك حصاد سائل Alan Toic ، الذي يحتوي على الفيروس ، ويتم تجميد الفيروس في النيتروجين السائل. في النهاية ، يمكن إجراء فحوصات البلاك والهيماجلوتينين لتحديد تأثير عيار الفيروس لآلان تويك الذي تم جمعه. يعد العرض المرئي للسوائل لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات الحصاد حساسة للغاية وتتطلب معالجة دقيقة للبيض ومعرفة جيدة بتشريحها.

قبل البدء في الإجراء ، تم الحصول على بيض دافيان المخصب الطازج الخالي من مسببات الأمراض في الدم من بائع مناسب. فور الوصول ، ضع البيض في حاضنة بيض رطبة مع تقليب بيض أوتوماتيكي لتدوير البيض بانتظام عند 37 درجة مئوية و 55 إلى 60٪ رطوبة لمدة 10 إلى 11 يوما. بعد سبعة إلى ثمانية أيام من الحضانة ، ارتداء قفازات مطهرة بالإيثانول بنسبة 70٪.

امسح شمعة البيض بالإيثانول وانقل البيض من الحاضنة إلى علب البيض الفارغة. ثم أطفئ الأنوار وأمسك الطرف الكبير للبيض ، واحدا تلو الآخر مقابل Candler. إذا كانت البويضة خصبة ، فيجب أن تكون الأوعية الدموية الرقيقة المؤدية إلى جنين على شكل حبة الفول مرئية بوضوح.

إذا كانت البويضة غير مخصبة ، ملاحظة بقعة دم صغيرة بها صفار بيضة مرئي. ثم تخلص من البيض غير المخصب وأعد البيض القابل للحياة إلى الحاضنة. إذا تعذر تأكيد حالة البويضة ، فقم بتمييزها للملاحظة اللاحقة في اليوم 10 أو 11 بعد الإخصاب وقبل الاستخدام مباشرة ، قم بتخفيف مخزون فيروس الأنفلونزا A إلى واحد في 10 إلى الثالث إلى 10 إلى الرابع PFU لكل مليلتر في PBS معقم مكمل بالهيبيين وضعه على الجليد.

ثم شمعة كل بيضة مرة أخرى وتخلص من أي أجنة ميتة غير متحركة بعد ذلك ، قم بإزالة ثلاث بيضات من الحاضنة ورتبها في حامل منفصل. مع رفع أكياس الهواء ، ضع علامة على المجال الجوي للبيض بعلامة دائمة.

ثم اغسل المنطقة فوق المجال الجوي بنسبة 70٪ من الإيثانول وانقل المجال الجوي للبيض إلى علبة بيض داخل غطاء السلامة البيولوجية BSL. استخدم الآن إبرة معقمة عيار 18 لعمل ثقب صغير في القشرة فوق كيس الهواء لكل بيضة. الحرص على عدم إدخال الإبرة بعمق شديد لتجنب طعن الجنين أو صفار البيض.

ثم اسحب فيروس الأنفلونزا المخفف في حقنة معقمة سعة ملليلتر واحد. قم بتوصيل إبرة قياس 22 وقم بتقديم الإبرة بعناية بزاوية 45 درجة في تجويف Alan Toic للبويضة الأولى. قم بحقن 0.2 مل من الفيروس المخفف في البيضة ، ثم بعد حقن البيضتين الأخريين ، تخلص من المحقنة والإبرة وأغلق كل ثقب بقطرة من الغراء من مسدس الغراء.

يتسرب الاعتناء بالغراء داخل البيضة ، ثم ضع البيض مرة أخرى في الحاضنة. بعد تلقيح جميع البيض ، احتضان البيض المصاب عند 37 درجة مئوية و 60٪ رطوبة دون أن يتحول إلى وقت الحضانة الأمثل. اعتمادا على نوع فيروس الأنفلونزا.

في نهاية فترة الحضانة ، قم بتبريد البيض لمدة أربع ساعات على الأقل عند أربع درجات مئوية لقتل الجنين وتضييق الأوعية الدموية. عندما يتم تبريد البيض بدرجة كافية. انقلها إلى غطاء للسلامة الحيوية وحامل ثابت ونظف أسطح البيض بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ثم استخدم مقصا معقما لفتح قشر البيض فوق كيس الهواء للبيضة الأولى. قم بإزالة القشرة حول الكيس الهوائي. الحرص على عدم إتلاف غشاء chorio Alan Toic.

ثم استخدم ملقطا غير حاد معقمة لفتح غشاء chorio Alan Toic وحرك الجنين وكيس الصفار جانبا برفق باستخدام ملعقة صغيرة أو ملعقة ، مع الحرص على عدم تمزق صفار البيض. بعد ذلك ، باستخدام ماصة مليلتر واحد ، اجمع بعناية سائل Alan Toic ، وقم بإمالة البيضة إلى الجانب لجمع أكبر قدر ممكن من السوائل حسب الضرورة. يجب أن تنتج كل بيضة ما بين خمسة إلى 10 ملليلتر من السائل المصفر قليلا أثناء حصاد كل بيضة.

تجمع سائل Alan Toic في أنابيب مخروطية بلاستيكية سعة 50 مل على الجليد. عندما يتم جمع كل السائل ، قم بتدوير الفيروس ونقل السائل الصافي إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر على الجليد. أخيرا ، تخلص من البيض في حاوية نفايات BSL وEloqua على الفور إلى سائل LAN المبهج.

ثم قم بتجميد الفيروس في النيتروجين السائل وضع السيقان المجمدة في ثلابة 80 درجة مئوية. للتخزين طويل الأمد ، تسبب عدوى فيروس الأنفلونزا تأثيرا اعتلالا خلويا ينتج عنه مناطق دائرية من الخلايا أو اللويحات التي تتشكل على طبقة أحادية من الخلايا. في هذه التجربة ، تم تصور اللويحات عن طريق تلطيخ الخلايا بالبنفسج البلوري وتم حساب 65 لويحة في البئر مع تخفيف الفيروس مرة واحدة في 10 إلى سالب 12 من الفيروس لأن 500 ميكرولتر قد تم زراعة مخزون فيروسي مخفف على الخلايا.

في هذه التجربة ، كان العيار النهائي 1.3 في 10 أس 14 PFU لكل مليلتر. اختبار أمة الهيماجلوتينين هو طريقة لمعايرة فيروس الأنفلونزا بناء على قدرة الفيروس على الالتصاق بسطح خلايا الدم الحمراء. كما لوحظ ، فإن المعلق الفيروسي يتراكم خلايا الدم الحمراء ويمنع خلايا الدم الحمراء من الاستقرار خارج التعليق.

لوحظت نتيجة سلبية واضحة مع تخفيف اثنين إلى سالب 10 من الفيروس في 50 ميكرولترا. ومن ثم، فإن العيار النهائي يساوي 2.1 في 10 أس الارتفاع العالي العالي الرابع لكل مليلتر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نشر فيروس الأنفلونزا عن طريق تلقيح بيض الدجاج وحصاد سائل المحيط الأطلسي الذي يحتوي على الفيروس.