Name: نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: تعلم طريقة إنتاج فيروس الإنفلونزا أ عالي التركيز باستخدام أجنة بيض الدجاج المخصب. تُستخدم هذه التقنية في دراسات علم الفيروسات وتطوير اللقاحات بكفاءة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم الدراسة الحالية من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة HL120947 (PC) و HL103868 (PC) وجمعية القلب الأمريكية Grant-in-Aid (PC.)

ملاحظة: ملاحظات عامة: تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على التلاعب في البيض تحت ظروف معقمة، وينبغي استخدام تقنية معقمة وفقا لذلك. قبل تنظيف جميع المعدات مع الايثانول 70٪ قبل الاستخدام. وبصفة عامة، ينبغي إجراء التلقيح فيروس الإنفلونزا، والحصاد في مختبر BSL-2. ومع ذلك، إذا تم استخدام هذا البروتوكول لنشر أكثر من ذلك بكثير المسببة للأمراض فيروسات الأنفلونزا (على سبيل المثال، والسلالات الوبائية وما قبل الوباء، والسلالات التي تشكل خطرا على الدواجن والماشية، سلالات أنفلونزا الطيور الشديدة الإمراض، وH1N1 سلالة 1918)، وارتفاع مستويات السلامة الأحيائية و في بعض الحالات، يطلب من احتياطات الأمن الحيوي والتراخيص. وينبغي للجنة السلامة الأحيائية المؤسسية المحلية الموافقة على جميع البحوث المتعلقة بفيروس الأنفلونزا. 1. إعداد بيض للتلقيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيض (SPF) خالية من مسببات الأمراض المخصبة حديثا المصل الطيور من بائع مناسبة. عادة، يتم استخدام بيض الدجاج. يجب أن يكون لنا البيضإد فور وصوله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على بيض مكان الوصول في حاضنة البيض مرطب مع تيرنر البيض التلقائي لتدوير البيض بانتظام. إذا كان تيرنر البيض التلقائي غير متوفر، وتناوب يدويا البيض على الأقل 2-3 مرات في اليوم (تأكد من ارتداء القفازات وإبقاء كل شيء كما عقيمة ممكن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض عند 37 درجة مئوية والرطوبة 55-60٪ عن 10-11 يوما. </li></ol> تشميع 2. البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كاندلر البيض لفحص البيض ضد الضوء الساطع في غرفة مظلمة للتحقق البيض للعقم قبل تشميع بعد حوالي 7 أو 8 أيام من الحضانة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح كاندلر البيض مع الايثانول 70٪. تغيير القفازات في كثير من الأحيان وتعقيم مع الايثانول 70٪ للحد من مخاطر التلوث عن طريق الجراثيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البيض من الحاضنة ووضعها في علب البيض الفارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطفاء الأنوار في الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد نهاية كبيرة من كل بيضة واحدة في وقت واحد ضد كاندلر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة البيض إلى determinه إذا كان خصبة أو العقم. ملاحظة: الأوعية الدموية رقيقة مما يؤدي إلى الجنين على شكل حبة وينبغي أن تكون واضحة للعيان. سوف تظهر بويضة غير مخصبة كما بقعة دم صغيرة مع صفار البيض وضوحا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل البيض التي هي غير مخصبة، والعودة البيض قابلة للحياة إلى الحاضنة. لا تترك البيض من خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة. إذا كانت حالة البويضة لا يمكن تأكيد، علامة عليه، والالتزام به في وقت لاحق. </li></ol> 3. إعداد فيروس اللقاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأسهم فيروس الأنفلونزا إلى حوالي 10 مارس - 10 أبريل PFU / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 10 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة). خطوة حاسمة: تمييع الأسهم فيروس فورا قبل الاستخدام والحفاظ على فيروس المخفف على الجليد في كل وقت. </li></ol> 4. فيروسات الأنفلونزا التلقيح عن طريق السقاء الطريق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم التلقيح فيروس (يوم 10 أو 11)، شمعة البيض مرة أخرى والقضاء على أي أجنة ميتة. تمييز الأجنة الحيةأبحث عن الحركة داخل البيضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ثلاث بيضات من الحاضنة، وترتيب البيض في حامل منفصل مع كيس الهواء فوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة المجال الجوي للبيض مع علامة دائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل قشر البيض فوق المجال الجوي مع 70٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البيض مع مساحة الهواء في كرتون البيض وإلى غطاء للسلامة الأحيائية (BSL-2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة معقمة 18G لكمة ثقب صغير في وعاء على كيس الهواء من كل بيضة. يجب الحرص على عدم ادخال الإبرة عميقا جدا لتجنب طعن الجنين أو صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فيروس الانفلونزا المخفف إلى معقمة 1 مل حقنة ونعلق إبرة 22G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع بعناية المحاقن مع إبرة في زاوية 45 درجة في جوف السقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 0.2 مل من فيروس الانفلونزا المخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الحقن مع غيرها من اثنين من البيض، ومن ثم التخلص من المحاقن والإبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم حفرة مع قطرة من الغراء من مسدس الغراء (أو ذاب شمع البارافين). Bالبريد الدقيق الذي الغراء لا تسرب داخل البويضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البيض مرة أخرى في حاضنة البيض مع وأشار المجال الجوي أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،2-4،12 حتى يتم تلقيح جميع البيض. </li></ol> 5. الحضانة الوقت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض المصابين دون تحول عند 37 درجة مئوية والرطوبة 60٪ ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الأمثل فترة حضانة تبعا لنوع فيروس الانفلونزا. احتضان الأنفلونزا A لمدة 48 ساعة. احتضان الإنفلونزا B و C لمدة 72 ساعة. </li></ol> 6. فيروسات الأنفلونزا الحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة، هدئ البيض عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات (أو O / N) لقتل الجنين وانقباض الأوعية الدموية للحد من مخاطر تلوث السائل السقاء بعدوى الدم. هل هذا لمنع خلايا الدم الحمراء من امتصاص الفيروس، مما يقلل من العائد. بدلا من ذلك، البيض البرد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية؛ ولكن هذا يزيد من خطر تلوث الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن كان البيض المبردة بما فيه الكفاية، ونقل البيض إلى غطاء للسلامة الأحيائية. وضع البيض إلى حامل ثابت مع كيس الهواء مواجهة. تنظيف السطح البيض مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص العقيمة لفتح قشر البيض فوق كيس الهواء. إزالة القشرة حول كيس الهواء مع الحرص على عدم تدمير غشاء مشيمائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح غشاء مشيمائي مع ملقط حادة معقمة. بلطف التحرك جانبا الجنين وكيس الصفار مع ملعقة صغيرة أو ملعقة. الحرص على عدم تمزق صفار البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 1 مل إيبندورف ماصة، وجمع بعناية السوائل السقاء. إذا لزم الأمر، إمالة البيض قليلا إلى الجانب لجمع السائل كما قدر الإمكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين السائل السقاء من جميع البيض في 50 مل أنبوب مخروطي البلاستيك. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات أثناء الحصاد الفيروس. غلة واحدة البيض من 5 - 10 مل من السائل مصفر قليلا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور السائل السقاء التي تحتوي على الفيروس في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 46؛ C لتكوير الحطام. نقل السوائل واضحا في أنبوب جديد 50 مل أبقى على الجليد. التخلص البيض في وعاء النفايات BSL-2. </li></ol> 7. التخزين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة فورا أوضح سقائية السائل (على سبيل المثال، 50، 100 أو 500 مأخوذة UL) والمفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل. نقل مخزونات فيروس المجمدة إلى -80 ° C الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل. </li></ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
<li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li>
<li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus%3A+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li>
<li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+and+the+challenge+for+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immu%22%5BJournal%5D)">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li>
<li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuing+challenges+in+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li>
<li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSzretter%2C+KJ+%22Current+protocols+in+microbiology%22">Current protocols in microbiology</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li>
<li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li>
<li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يسبب الإنفلونزا في العبء العالمي للمرض واسع، ويستمر العمل في فهم التسبب في إصابة الرئة 7. لبحث سهلت في هذا المرض الفتاك، وضعت أساليب مختلفة لنشر فيروس انفلونزا 6. هنا، نحن تصف تقنية لإنتاج فيروس الإنفلونزا في بيض الدجاج. وميزة هذه الطريقة هي أنها تكرار للغاية والنتائج في كميات كبيرة من مخزونات فيروس أنفلونزا عيار عالية، والتي غالبا ما تكون ضرورية للدراسات في المختبر. ومعظم المختبرات...

الأنفلونزا A لا يزال يشكل خطرا كبيرا على صحة الإنسان. وهو مرض الجهاز التنفسي يمكن أن يكون مدمرا مع العبء العالمي الكبير يسبب ما يصل إلى 500،000 حالة وفاة سنويا حول العالم 1. فيروسات الأنفلونزا هي في الأسرة فيروسات مخاطية قويمة وتحمل 8-الشعور السلبي RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل في الجينوم من 1،2. التحولية عالية (أي الأنتيجين &quot;الانجراف&quot;) من الجينوم الفيروسي يمنع مناعة طويلة الأمد. وعلاوة على ذلك، الانفلونزا بشكل متزايد مقاومة للعقاقير المضادة للفيروسات 3. سلط الضوء على وباء انفلونزا H1N1 2009 جميع القضايا الصعبة المرتبطة بمرض أنفلونزا (سلالة وبائية، ومقاومة مضادة للفيروسات، وإنتاج لقاح تأخر). يتم تحديد تركيبة اللقاح سنويا من قبل منظمة الصحة العالمية لسلالات الأنفلونزا الأكثر احتمالا المسببة للأمراض (واحد في كل من H1N1، H3N2 وانفلونزا B) 4. لأنه يعتمد هذا الأسلوب على سلالة انفلونزا تنبأالصورة، وأحيانا تحديدها بشكل غير صحيح السلالات المسببة للأمراض وقطرات نجاعة اللقاح بشكل كبير. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ظهور سلالات الأنفلونزا الجديدة الالتفاف على هذه البرامج الوقائية المسببة للأمراض الوبائية 2. وقد تم إنشاء لقاح الأنفلونزا العالمي راوغ 5. لذلك، يجب أن تستمر الأبحاث في فهم التسبب في إصابة الرئة. لالبحوث المختبرية المرفق، وقد وضعت عدة طرق لعزل الفيروسية ونشر 6. يمكن أن فيروسات الأنفلونزا البشرية أن تتسع دائرة في مجموعة متنوعة من ركائز خلايا الثدييات. ومع ذلك، فإن أفضل طريقة لتحقيق توليد الفيروسات عيار عالية بكميات كبيرة في البيض المحتوي. يصف بروتوكول التالية تقنية لنشر فيروس الأنفلونزا A والتخزين من مخزونات فيروس القائمة.

محلول <table><tbody><tr><td>ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>مصل الدم الخالي من مسببات الأمراض (SPF) بيض الدجاج المخصب &nbsp;</td>حاضنة البيض المرطب <td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>موديل 2100</td><td></td></tr><tr><td>تيرنر بيض أوتوماتيكي</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>موديل 3200</td><td></td></tr><tr><td>شمعة</td><td>بيض FARM iNNOVATORS</td><td>موديل 3300 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>1 مل حقنة</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18G إبرة</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20G / 22G إبرة</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol >99.5٪</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>مخفف إلى 70٪ باستخدام</td></tr><tr><td>مسدس غراء الماء "Ad tech Hi Temp Project Pro "</td><td>Ad Tech، Adhesive Technologies، Inc.</td><td>نموذج 1105</td><td></td></tr><tr><td>الغراء "Ad tech MINI SIZE ، Multi Temp"</td> <td>Ad tech ، Adhesive Technologies ، Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>خلايا MDCK</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>خلايا الدم الحمراء المغسولة المجمعة في تركيا ، 10٪</td> <td>مختبرات لامبير</td><td>البيولوجية 724908</td><td></td></tr></tbody></table>

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

ويرتبط عدوى الإنفلونزا مع حوالي 36،000 حالة وفاة وأكثر من 200،000 المستشفيات كل عام في الولايات المتحدة. ظهور المستمر من سلالات فيروس الإنفلونزا الجديدة بسبب طفرة وإعادة تشكيلة-يعقد السيطرة على الفيروس ويتطلب التطوير الدائم لأدوية جديدة واللقاحات. الدراسة المختبري للأنفلونزا تتطلب طريقة موثوق بها وفعالة من حيث التكلفة لنشر الفيروس. هنا، يتم توفير بروتوكول شامل للأنفلونزا A انتشار الفيروس في بيض الدجاج الخصبة والتي ينتج باستمرار عيار ارتفاع الأسهم الفيروسية. وباختصار، يتم تحضين خالية من مسببات الأمراض المصل (SPF) بيض الدجاج المخصب عند 37 درجة مئوية والرطوبة 55-60٪ لمدة 10 - 11 يوما. خلال هذه الفترة، تطور الجنين يمكن رصدها بسهولة باستخدام كاندلر البيض. ويتم التلقيح خارج الفيروس عن طريق الحقن من الأسهم الفيروس في جوف السقاء باستخدام إبرة. 2 بعد أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، والبيضمبردة لمدة 4 على الأقل ساعة على 4 درجات مئوية. قشر البيض فوق كيس الهواء وغشاء مشيمائي يتم بعد ذلك فتحت بعناية، ويتم حصاد السائل السقاء التي تحتوي على الفيروس. تم مسح السوائل من الحطام بواسطة الطرد المركزي، aliquoted ونقل إلى -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. وقد جعلت كمية كبيرة (5-10 مل من السوائل في البيض التي تحتوي على فيروس) وفيروس عيار عالية والتي عادة ما يتحقق مع هذا البروتوكول استخدام البيض لتحضير فيروس أسلوبنا مواتية، ولا سيما بالنسبة للفي الدراسات المختبرية التي تتطلب كميات كبيرة من الفيروسات التي هناك حاجة جرعات عالية من الأسهم الفيروس نفسه.

وقد تم تطوير طرق متعددة لعيار الفيروس الأنفلونزا. واحد الاعتبار عند اختيار الطريقة المناسبة هي التي تحدد بعض مجموع الجسيمات بغض النظر عن جدوى (على سبيل المثال، راصة دموية الفحص) في حين تستند الآخرين على العدوى، والتي سوف تقيم virions قابلة للحياة (على سبيل المثال، فحص اللوحة) 6. هنا، تم تحديد عيار الفيروسية من السوائل السقاء تم جمعها من بيض الدجاج تلقيح مع فيروس الإنفلونزا تكييفها الماوس (A / PR / 8/34) عن طريق فحص اللوحة (الشكل 1)، وم...

يستخدم بيض الدجاج الخصب على نطاق واسع لإنتاج كميات كبيرة من فيروس الأنفلونزا البشرية A لأنه يوفر نظاما مناسبا وفعالا من حيث التكلفة لإثبات إنتاجية عالية من الفيروس.

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج كميات كبيرة من فيروس الإنفلونزا بتركيز عالٍ، وذلك باستخدام نظام فعال من حيث التكلفة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال الحصول على بيض دجاج مخصب حديثاً وخالٍ من الممرضات المصلية. وفي الخطوة الثانية، يتم حقن البيض بفيروس الإنفلونزا عبر طريق Alan Toic.لمدة 48 ساعة، يتم بعد ذلك جمع سائل جميعي ألانتويك (Alan Toic fluid) الذي يحتوي على الفيروس، ثم يُجمد الفيروس تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل. وفي النهاية، يمكن إجراء اختبارات اللويحات (plaque assays) واختبارات التلازن الدموي (hemagglutinin assays) لتحديد تأثير عيار الفيروس في سائل ألانتويك الذي تم جمعه. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات الجمع حساسة للغاية وتتطلب تعاملاً دقيقاً مع البيض ومعرفة جيدة بتشريحها.قبل البدء في الإجراء، يتم الحصول على بيض طيور مخصب حديثاً وخالٍ من مسببات الأمراض المصلية من مورد مناسب. وفور وصول البيض، يوضع في حاضنة بيض مرطبة مزودة بقلاب آلي لتدوير البيض بانتظام عند درجة حرارة 37 degrees Celsius ورطوبة تتراوح بين 55 إلى 60% لمدة تتراوح من 10 إلى 11 يوماً. وبعد فترة تحضين تستمر من سبعة إلى ثمانية أيام، يتم ارتداء قفازات معقمة بـ 70%ethanol.امسح جهاز فحص البيض (الكاندر) بالإيثانول وانقل البيض من الحاضنة إلى كراتين البيض الفارغة. ثم أطفئ الأنوار وأمسك الطرف العريض من كل بيضة، واحدة تلو الأخرى، مقابل جهاز الفحص. إذا كانت البيضة مخصبة، فيجب أن تظهر بوضوح أوعية دموية رفيعة تؤدي إلى جنين يشبه حبة الفاصوليا.إذا كانت البيضة غير مخصبة، ستظهر بقعة دموية صغيرة مع صفار بيضة مرئي. حينئذٍ، تخلص من البيض غير المخصب وأعد البيض القابل للحياة إلى الحاضنة. وإذا تعذر التأكد من حالة البيضة، ضع عليها علامة لملاحظتها لاحقاً في اليوم 10 أو 11 بعد الإخصاب، وقبل الاستخدام مباشرةً، خفف مخزون فيروس الإنفلونزا A إلى 1×10³ إلى 10⁴ PFU لكل مل في محلول PBS معقم مضاف إليه hippies وضعه على الثلج.بعد ذلك، قم بفحص كل بيضة عن طريق تسليط الضوء عليها (Candling) مرة أخرى واستبعد أي أجنة ميتة وغير متحركة. تالياً، أخرج ثلاث بيضات من الحاضنة ورتبها في حامل منفصل. ومع توجيه الأكياس الهوائية للأعلى، حدد مساحة الفراغ الهوائي في البيض باستخدام قلم تحديد دائم.بعد ذلك، اغسل المنطقة الموجودة فوق الغرفة الهوائية بـ 70%ethanol وانقل البيض بحيث تكون الغرفة الهوائية للأعلى إلى كرتونة بيض داخل غطاء سلامة بيولوجية من المستوى الثاني BSL two. الآن استخدم إبرة معقمة بقياس 18 gauge لثقب ثقب صغير في القشرة فوق الكيس الهوائي لكل بيضة، مع الحرص على عدم إدخال الإبرة بعمق شديد لتجنب طعن الجنين أو المح. بعد ذلك، اسحب فيروس الإنفلونزا المخفف في حقنة معقمة سعة واحد ملليلتر. قم بتركيب إبرة عيار 22 وادفع الإبرة بعناية بزاوية 45 درجة داخل التجويف السلوي للبيضة الأولى. احقن 0.2 ملليلتر من الفيروس المخفف في البيضة، وبعد حقن البيضتين الأخريين، تخلص من الحقنة والإبرة وقم بسد كل ثقب بقطرة من الغراء باستخدام مسدس الغراء.تأكد من عدم تسرب الغراء داخل البيضة، ثم أعد البيض إلى الحاضنة. بعد تلقيح جميع البيض، يتم تحضين البيض المصاب عند 37 °C ورطوبة 60% دون تقليب للمدة المثالية للتحضين، وذلك اعتماداً على نوع فيروس الإنفلونزا.في نهاية فترة الحضانة، يتم تبريد البيض لمدة لا تقل عن أربع ساعات عند درجة حرارة 4 °C لقتل الجنين وتضييق الأوعية الدموية. وعندما يتم تبريد البيض بشكل كافٍ، يُنقل إلى غطاء السلامة البيولوجية وفي حامل ثابت، ثم تُنظف أسطح البيض باستخدام 70% ethanol.ثم استخدم مقصاً معقماً لفتح قشرة البيضة فوق الكيس الهوائي للبيضة الأولى. قم بإزالة القشرة المحيطة بالكيس الهوائي، مع الحرص على عدم إتلاف الغشاء الكوريوني السلوي.بعد ذلك، استخدم ملقطاً غير مدبب ومعقماً لفتح الغشاء الكوريوني السلوي، ثم حرك الجنين وكيس المح ببطء جانباً باستخدام ملعقة صغيرة أو سباتولا، مع الحرص على عدم تمزيق كيس المح. بعد ذلك، وباستخدام ماصة سعة 1 mL، اجمع السائل السلوي بعناية، مع إمالة البيضة إلى الجانب لجمع أكبر قدر ممكن من السائل حسب الضرورة. يجب أن تعطي كل بيضة ما بين 5 إلى 10 mL من سائل مائل للاصفرار عند حصاد كل بيضة.يتم تجميع سائل Allantoic في أنابيب بلاستيكية مخروطية سعة 50 milliliter على الثلج. وعند الانتهاء من جمع كافة السوائل، يتم إجراء عملية طرد مركزي لترسيب الفيروس ونقل السائل الرائق إلى أنبوب جديد سعة 50 milliliter على الثلج. وأخيرًا، يتم التخلص من البيض في حاوية نفايات BSL 2 والبدء فورًا في معالجة سائل Allantoic المصفى.بعد ذلك، قم بالتجميد السريع للفيروس في النيتروجين السائل، ثم ضع الأنابيب المجمدة في مجمد بدرجة حرارة 80- درجة مئوية. وبالنسبة للتخزين طويل الأمد، تسبب عدوى فيروس الإنفلونزا تأثيراً اعتلالياً خلوياً يؤدي إلى ظهور مناطق دائرية من الخلايا المتآكلة أو ما يعرف باللويحات (plaques) التي تتشكل على طبقة أحادية من الخلايا. في هذه التجربة، تم تصوير اللويحات عن طريق صبغ الخلايا بصبغة البنفسج البلوري (crystal violet)، وتم عد 65 لويحة في البئر الذي يحتوي على تخفيف من الفيروس بنسبة 1 × 10⁻¹² لأن 500 µL من المخزون الفيروسي المخفف قد تم استنباتها على الخلايا.في هذه التجربة، بلغ العيار النهائي 1.3 × 10¹⁴ PFU لكل ملليلتر. ويُعد مقايسة تثبيت الهيماجلوتينين طريقة لتعيير فيروس الإنفلونزا بناءً على قدرة الفيروس على الالتصاق بسطح خلايا الدم الحمراء. وكما لوحظ، فإن المعلق الفيروسي يعمل على تجميع خلايا الدم الحمراء، مما يمنعها من الترسيب خارج المعلق.لُوحظت نتيجة سلبية واضحة عند تخفيف الفيروس بنسبة 2⁻¹⁰ في 50 µL. وبناءً على ذلك، فإن العيار النهائي هو 2.1 × 10⁴ HAU لكل ملليلتر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تكثير فيروس الإنفلونزا عن طريق تلقيح بيض الدجاج، وحصاد السائل السلوي الذي يحتوي على الفيروس.

influenza-virus-propagation-in-embryonated-chicken-eggs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

الانقاذ من فيروسات الانفلونزا من الحمض النووي البلازميد هو تقنية أساسية وضرورية التجريبية التي تسمح للباحثين لتوليد فيروسات الانفلونزا المؤتلف لدراسة جوانب متعددة في البيولوجيا من فيروس الانفلونزا ، وإلى أن تستخدم ناقلات المحتملة أو اللقاحات.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

والعدوى المتزامنة مع فيروس الأنفلونزا A هو واحد من العوامل المتورطة في تحريض أمراض الرئوية الغازية خلال...

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

يوضح هذا الفيديو تقنية لتوليد متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة أحادية النسيلة لفيروس الأنفلونزا. يتم حقن معلق الفيروس المحايد بالأجسام المضادة في بيض الدجاج الجنين لنشر متغيرات الهروب بشكل انتقائي. ينتج عن هذا مجموعة من الفيروسات في الغالب من متغيرات الهروب ، والتي تم تأكيدها عن طريق مقايسة التضخم الدموي.

توليد متغيرات هروب فيروس الأنفلونزا ضد الأجسام المضادة المعادلة

يعرض الفيديو طريقة لإنشاء فيروسات الأنفلونزا المؤتلفة المتكيفة مع البرد. إنه ينطوي على نقل الخلايا البشرية ببلازميدات ثنائية الاتجاه ، تليها الحضانة عند حضانة درجة حرارة منخفضة لإنتاج فيروسات مناسبة لإنتاج اللقاح ، تتميز بانخفاض التكاثر المتماثل في الظروف الأكثر دفئا.

توليد فيروسات الأنفلونزا الحية المؤتلفة الموهنة للقاحات

نيوكاسل فيروس المرض (NDV) وقد درس على نطاق واسع في السنوات القليلة الماضية من أجل تطوير ناقلات جديدة للتطعيم والعلاج وغيرها. وكانت هذه الدراسات ممكن نظرا لتقنيات لانقاذ الفيروس المؤتلف من [كدنا]، مثل تلك التي وصفنا هنا.

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

تم عرض نماذج عدوى الزرد الجهازية والموضعية لفيروس الأنفلونزا البشرية A. باستخدام نموذج العدوى الجهازية ، يمكن استخدام أسماك الزرد لفحص الأدوية المضادة للفيروسات. باستخدام نموذج عدوى موضعي ، يمكن استخدام أسماك الزرد لتوصيف استجابات الخلايا المناعية المضيفة.

باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية

هنا ، قدمنا طريقة لتحقيق الترانفيس المستقر لطفيليات الأيفريا الدجاج من قبل النيوليوبوكتينغ سبوروزويبس أو الجيل الثاني merozoites. ويمكن استخدام الطفيليات الأيميرية المعدلة وراثياً التي تعبر عن الجينات المغايرة للجينات المغايرة كوسائل لإيصال اللقاح.

النوكليوفوكساتيون وفي فيفو نشر طفيليات الايميريا الدجاج

الهدف العام من هذه الورقة هو وصف كيفية إجراء الحقن داخل الخلايا في البويضة للمواد الخارجية في أجنة الدجاج. هذا النهج مفيد جدا لدراسة البيولوجيا التنموية لأجنة الدجاج.

في أوفو الحقن داخل الأوعية الدموية في أجنة الدجاج

نقدم هنا إجراء مفصلا لإنتاج وتنقية وتحديد كمية فيروس مرض نيوكاسل المؤتلف عالي العيار. ينتج عن هذا البروتوكول باستمرار &gt; 6 × 109 وحدات لتشكيل اللويحات / مل ، مما يوفر كميات الفيروس المناسبة للدراسات الحيوانية في الجسم الحي . يتم وصف اختبارات مراقبة الجودة الإضافية لضمان السلامة في الجسم الحي .

إنتاج فيروس مرض نيوكاسل المؤتلف عالي العيار من سائل ألانتويك

تعرض هذه الطريقة جنين الدجاج كنموذج بسيط وفعال من حيث التكلفة في الجسم الحي لإحياء العامل الممرض البكتيري L. monocytogenes من حالة قابلة للحياة ولكنها غير قابلة للزراعة (VBNC) ومع استخدامات أخرى محتملة في فهم آليات السكون البكتيري.

جنين الدجاج كنموذج في الجسم الحي لإحياء مسببات الأمراض القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة

تعلم طريقة إنتاج فيروس الإنفلونزا أ عالي التركيز باستخدام أجنة بيض الدجاج المخصب. تُستخدم هذه التقنية في دراسات علم الفيروسات وتطوير اللقاحات بكفاءة عالية.

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

استكشف المزيد من الفيديوهات