تسجيل الخفيفة أثار-الردود بعد المشبكي في الخلايا العصبية في الظلام تكييفها، الاستعدادات ماوس الشبكية شريحة عن طريق تقنيات المشبك التصحيح

الهدف العام من هذه التجربة هو الحصول على تسجيلات استجابة للضوء من الخلايا العصبية الشبكية المتكيفة المظلمة. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد عين الفأر أولا. الخطوة الثانية هي عزل شبكية العين وقطعها لتحضير الشريحة.

بعد ذلك ، يتم تركيب مستحضر الشبكية وعرضه على المجهر للعثور على خلية مستهدفة لتسجيلات مشبك التصحيح. بعد إنشاء تكوين مشبك رقعة الخلية بالكامل ، يتم تطبيق حافز ضوئي بالقرب من الخلية. أخيرا ، حيث يمكن ملاحظة الاستجابة الفيزيولوجية الكهربية المتزامنة من خلال برنامج الاستحواذ.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل تصوير KRC ، هي أن حساسية التسجيل عالية ، ويمكن تحديد خلايا التسجيل شكليا. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن العمل في الظلام الدامس قد يكون صعبا ومربكا لأولئك الذين لم يعتادوا على القيام بذلك. لبدء النطاق، أدوات التشريح ونقل الماصات بالقرب من مجهر التشريح.

سيتم تنظيم منطقة العمل بشكل جيد بحيث يمكن الوصول إلى كل أداة بسهولة في الظلام. عندما تكون جاهزا ، قم بفجر عارض الأشعة تحت الحمراء لإجراء الإجراء في الظلام. بعد القتل الرحيم بسرعة في نواة العينين ووضعها في طبق من محلول تشريح بارد ، يحفظ في صندوق مظلم يعمل تحت المجهر.

انقل العين إلى طبق بمحلول تشريح بارد. فقاعات باستمرار مع الأكسجين. لإزالة القرنية والعدسة، أمسك العصب البصري في الطرف الآخر من مقلة العين لمنعه من الحركة وقم بعمل شق في الجزء العلوي من القرنية بسكين جراحي مجهري.

قم بتمديد الجرح باستخدام مقص جراحي وإزالة القرنية ، مع ترك بعض الصلبة المحيطة بها. بعد ذلك ، أمسك العدسة بالملقط الدقيق واسحبها للخارج ببطء. بمجرد صنع كوب العين ، اسكب محلول التشريح البارد المؤكسج برفق في كوب العين باستخدام ماصة نقل صغيرة.

اعمل بسرعة للحفاظ على شكل شبكية العين واستخدم ضغطا لطيفا لتحديد الجانبين الظهري والبطني لشبكية العين. استخدم أجهزة المشاهدة بالأشعة تحت الحمراء لتحديد الخط الذي يمر عبر كوب العين الشبكي ، ويمر بالقرب من رأس العصب البصري. يمر هذا الخط في الغالب عبر الجانب البطني للعصب البصري والجانب ، بما في ذلك العصب البصري ، هو الجانب الظهري.

اعتمادا على التجربة ، قم بعمل قطع على الجانب البطني أو الظهري. هذا يمثل الجانب غير الضروري وهو علامة مفيدة للمضي قدما. بعد ذلك ، قم بإزالة الجسم الزجاجي برفق باستخدام ملقط دقيق للغاية دون لمس شبكية العين.

يرتبط الجسم الزجاجي بشكل أساسي بالجزء السفلي والحافة الخارجية لكوب العين. نظرا لأن الجسم الزجاجي قد يكون مرتبطا بإحكام بكوب العين ، استمر برفق لإزالة انفصال الشبكية. استمر في السحب حتى لا يشعر بالتوتر.

بمجرد عزل الشبكية ، أمسك الصلبة وقشر شبكية العين برفق. باستخدام الجانب الخلفي من الملقط ، قم بقص شبكية العين وتخلص من النصف غير الضروري في نفس الطبق البلاستيكي. قطع الشبكية المتبقية إلى قطعتين لكل قطعة.

اقطع الحواف لعمل لوح شبكية العين وتقليم الحواف القابلة للطي. بعد ذلك ، استخدم ماصة نقل كبيرة لنقل لوح شبكية العين إلى صفيحة زجاجية. امتص المحلول الزائد بماصة صغيرة واستخدم قطعة من ورق الترشيح لتسطيح البلاطة.

ضع قطعة من غشاء المرشح برفق فوق الأنسجة باستخدام ماصة نقل صغيرة. ضع قطرة من محلول التشريح على غشاء المرشح. انتظر حوالي 15 ثانية حتى ينتشر المحلول ويلتصق بأنسجة الشبكية بغشاء المرشح.

بمجرد الالتصاق ببعضهما البعض ، اسكب المزيد من محلول التشريح البارد أسفل الفلتر وحوله حتى يطفو الغشاء. بعد ذلك ، ضع غشاء المرشح في غرفة التقطيع وقم بتغطيته بمحلول التشريح. العمل بسرعة لضمان عدم جفاف الغشاء ، استخدم المروحية لتقطيع أنسجة الشبكية إلى شرائح.

ضع زلة غطاء بلاستيكية مع قضبان شحوم في غرفة التقطيع. انقل شريحة الشبكية فوق قضبان الشحوم وقم بتدوير الشريحة 90 درجة بحيث يكون المقطع العرضي مرئيا. اضغط على غشاء المرشح لأسفل على زلة الغطاء قبل تغطية جوانب ورق الترشيح بالشحوم.

بعد تثبيت الشرائح على زلة غطاء بلاستيكي ، انقلها إلى طبق بلاستيكي مقاس 33 ملم. اغمر المستحضر بمحلول تشريح الفحم وقم بتخزين كل طبق في صندوق مظلم مؤكسج باستمرار. لتسجيلات مشبك التصحيح.

قم بتجهيز أنابيب الوفرة بأهداف متوسطة والسماح لجميع الفقاعات بالمرور من الأنبوب. بعد عمل ماصات التسجيل باستخدام قطبي زجاجي، قم بإعادة ملء الطرف بمحلول الماصة. بعد ذلك، استخدم حشو ماصة صغيرة لملء حوالي ثلث الماصة بمجرد ملئها، وقم بتخزين كل ماصة في صندوق ماصة رطب.

بعد ذلك ، قم بتشغيل المعدات الخاصة بتسجيلات مصنع التصحيح ، بما في ذلك مكبر للصوت وكاميرا CCD لمضخم الكمبيوتر والمجهر الذي يعمل في الظروف المظلمة. ضع شريحة الشبكية على مرحلة المجهر بمساعدة عارض الأشعة تحت الحمراء. بعد تجميدها ، ابدأ التروية المستمرة.

اضبط درجة حرارة التروية على 33 إلى 37 درجة مئوية. اعرض سطح الشريحة بكاميرا CCD. ركز على الموقع المستهدف.

مع وجود أنواع الخلايا المستهدفة ، حدد خلية ذات مظهر صحي لتسجيل مرابط التصحيح. بمجرد تحديد الخلية السليمة، ضع ماصة التسجيل في حامل الماصة وقم بدفع الماصة إلى تحضير الشريحة. عندما تكون قريبة من تحضير الشريحة ، ابحث عن طرف الماصة بالمجهر.

بمجرد أن يصبح طرف الماصة مرئيا تحت المجهر ، حرك الطرف لأسفل باتجاه الخلية المستهدفة. بعد ذلك ، اضبط مكبر الصوت واضبط الماصة على مضخم البيكا. خمسة فولت لكل نانا أمبير.

ابدأ نبضة كهربائية مستمرة تبلغ حوالي خمسة مللي فولت وحوالي 10 هرتز وتحقق من مقاومة الماصة. المقاومة المثالية بين خمسة و 12 ميجا أوم. بالنسبة لمعظم الخلايا العصبية في الشبكية.

عندما تصبح جاهزا ، استخدم لسان حال أو حقنة لتفجير المحلول الداخلي حتى يصبح طرف الماصة على سطح الخلية المستهدفة. عندما يتسبب الضغط الإيجابي في ظهور غمازة صغيرة على سطح الخلية ، قم بتقديم الطرف قليلا وتوقف عن النفخ. إذا كانت مقاومة الماصة تتزايد باستمرار، فاتركها وراقب المقاومة حتى تصل إلى أكبر من جيجا أوم واحد.

إذا لم تزداد المقاومة تلقائيا ، فقم بالضغط السلبي برفق حتى يصبح ختما جيجا. بعد تحقيق مانع التسرب الجيجا، قم بتغيير إمكانات التثبيت إلى سالب 70 مللي فولت ثم قم بالضغط السلبي بشكل متقطع لتمزق الغشاء داخل طرف الماصة. عندما يتم تكوين الخلية بالكامل ، يمكن أن تتراوح مقاومة الماصة بين 500 ميجا أوم وجيجا أوم واحد ، ويمكن ملاحظة التيار السعوي.

سجل العلاقة الوريدية من سالب 80 إلى 40 مللي فولت. سيتم تنشيط أنواع مختلفة من القنوات ذات الجهد المسور اعتمادا على نوع الخلية. أخيرا ، سجل الضوء الذي أثار التيارات أو الفولتية المشبكية.

تحضير الشريحة هذا الذي تم عرضه عند 10 × كلا من المستقبلات الضوئية والخلايا العقدية بدون انفصال عن ورق الترشيح. عندما يتم عرض هذا المستحضر بهدف 60 × ، يتم ملاحظة كل طبقة خلية بوضوح. تم استحضار إمكانات ما بعد المشبكي المثيرة للضوء من الخلايا العصبية في الشبكية استجابة لضوء الخطوة.

تختلف سعة الذروة ووقت الاضمحلال اعتمادا على نوع الخلية والنوع الفرعي. تم الكشف عن نوع الخلية ونوعها الفرعي المورفولوجي عن طريق وضع العلامات على الكبريت بعد التسجيلات الفسيولوجية بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للعلماء في مجال أبحاث شبكية العين لدراسة وظائف الإشارات البصرية الطبيعية ، فضلا عن مساهمات الآليات المتشابكة.