الكشف عن Exosomal العلامات البيولوجية التي يسببها الميدانية الكهربائية الإصدار والقياس (EFIRM)

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخلاص الإكسوسومات بكفاءة من السوائل الحيوية، وإفراغ محتوياتها، وتحليل هذا المحتوى بسرعة. ويتم تحقيق ذلك من خلال استخلاص الإكسوسومات أولاً من السوائل الحيوية باستخدام جسيمات دقيقة مغناطيسية مرتبطة بأجسام مضادة تستهدف علامات الإكسوسومات، ثم تحميل الإكسوسومات المستخلصة على سطح قطب كهربائي. بعد ذلك، يتم تحليل الإكسوسومات باستخدام مجال كهربائي، ثم يتم تهجين محتويات الإكسوسومات مع مجسات موجودة على سطح القطب الكهربائي.

يتم أيضاً تهجين جزيء كاشف بالنظام. وتتمثل الخطوة النهائية في إضافة محلول مادة الركيزة إلى سطح القطب الكهربائي، ومن ثم الحصول على القراءة من خلال قياس التيار الكهربائي. وفي النهاية، يُستخدم القياس الكهروكيميائي للتيار لتحديد كمية محتوى الحمض النووي أو البروتين في عينة الإكسوسوم.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية، مثل الطرد المركزي الفائق ومحلول الليسين المنظم، في كونها طريقة بسيطة وسريعة لاستخلاص محتوى الإكسوسومات واختباره. نحن متحمسون جداً لهذه التقنية لأن تقنية efim، ولأول مرة، تتيح لنا الاستفادة من المعلومات التي تفرزها الأعضاء في حالات المرض أو الحالة الطبيعية، والتي يتم إفرازها من العضو الأصلي عبر الأوعية الدموية وصولاً إلى تجويف الفم. تتيح لنا هذه التقنية التقاط هذه المعلومات وتحرير المحتوى الجزيئي الذي يمكننا الكشف عنه في آن واحد وبطريقة مرنة.

بشكل عام، قد يواجه المستخدمون الجدد لهذه الطريقة صعوبة لأن استخدام الجسيمات الدقيقة المغناطيسية قد يكون شاقاً إذا لم يتم توخي الحذر. علاوة على ذلك، قد يمثل استخدام الطرق الكهروكيميائية في تحليل العينات البيولوجية نموذجاً جديداً للبعض. لذا، يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم كيفية التعامل مع الجسيمات الدقيقة المغناطيسية والتحميل الكهربائي. ويجب اتخاذ عناية خاصة عند التعامل مع الجسيمات الدقيقة المغناطيسية وتحميلها على الأقطاب الكهربائية.

للبدء، قم بإعادة تعليق محلول مخزون يحتوي على 10 µg/mL من الجسيمات الدقيقة المغناطيسية المغلفة بـ strept adin وأضف 5 µL من المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 495 µL من PBS لغسل الخرزات. أولاً، ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وأزل المنظم بعناية دون تحريك الخرزات.

بعد ذلك، انقل الأنبوب إلى حامل غير مغناطيسي. أضف 500 µL من PBS و PET لغسل الخرزات. كرر هذه العملية ثلاث مرات إجمالاً، ثم أعد تعليق الخرزات بعد الغسلة النهائية.

قم بتعليق الحبيبات في 490 µL من PBS، ثم أضف 5 µL من Biotinylated mouse anti-human CD 63 antibody من محلول مخزون بتركيز 1 mg/mL. اخلط المحلول عن طريق السحب والضخ بواسطة الماصة، ثم قم ببرمجة جهاز تدوير العينات (sample rotator) لإجراء دوران تبادلي بزاوية 90 درجة لمدة خمس ثوانٍ واهتزاز بزاوية 5 درجات لمدة ثانية واحدة. ضع الأنابيب في جهاز التدوير وقم بتشغيل البرنامج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، انقل الأنابيب إلى الحامل المغناطيسي لمدة خمس دقائق. اغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام 500 µL من PBS ثم أعد تعليقها في 490 µL من PBS يحتوي على Caine. ضع ملصقاً على أنبوب يتضمن تعريف العينة، ثم أضف 10 µL من العينة مع سحبها وإسقاطها بالماصة عدة مرات لخلط العينة مع الحبيبات المقترنة بالأجسام المضادة.

بعد ذلك، انقل الأنابيب إلى جهاز تدوير العينات وقم بتشغيل البرنامج نفسه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 500 µL من محلول tris hydrochloride المنظم بتركيز 1 M. باستخدام الرف المغناطيسي، تصبح الإكسوسومات الآن مرتبطة بالخرزات المغناطيسية لتهيئة القطب الكهربائي.

أولاً، يتم تخفيف الكواشف المخزونة للمسبار، وكلوريد البوتاسيوم، ومونومر ole في ماء مقطر. مسبار DNA المبيوتين الخماسي مخصص لـ GA DH mRNA. اخلط محلول المسبار المونومري باستخدام جهاز vortex.

استخدم مصفوفة أقطاب كهربائية مكونة من 16 مستشعراً، حيث يتكون كل قطب وحدة من أقطاب عاملة ومقابلة ومرجعية مكونة من الذهب النقي. ضع بئراً بلاستيكياً فوق مصفوفة الأقطاب لمنع التلوث الخلطي للأقطاب. انقل 60 µL من محلول مسبار المونومر إلى سطح قطب ذهبي بحيث تغمر السوائل الأقطاب العاملة والمقابلة والمرجعية.

قم بتطبيق ملف تعريف لمجال كهربائي مربع دوري يُعرف بمجال A-C-S-W-E لبلمرة مسبار مونويمر كهربائياً. يؤدي ذلك إلى تكوين طبقة بوليمر موصلة على سطح القطب الكهربائي. اشطف المستشعر ثلاث مرات بالماء المقطر، ثم جففه باستخدام غاز النيتروجين لإزالة السوائل من سطح القطب.

بعد طلاء القطب الكهربائي مسبقاً بمسبار الالتقاط، أضف 5 µL من محلول بتركيز 1 µM من مسبار الكشف إلى 495 µL من محلول معقد الإكسوسوم والخرزات، ثم اخلط المزيج عن طريق السحب والضخ بالماصة. المسبار هنا عبارة عن بادئ DNA مقترن بالفلوريسين في الطرف '3 وهو متخصص لـ GA dh. ضع مصفوفة أقطاب كهربائية مطلية مسبقاً فوق مصفوفة مغناطيسية تتكون من 16 مغناطيساً محاذية للأقطاب الكهربائية العاملة للمستشعر.

بعد ذلك، يتم نقل 60 µL من محلول الإكسوسومات المرتبطة بالخرزات إلى سطح القطب الكهربائي. يتم تطبيق مجال A-C-S-W-E لمدة 20 دورة. ستتهجن حمولة الإكسوسومات المنطلقة مع المسبار الموجود على سطح القطب الكهربائي.

اشطف سطح القطب الكهربائي ثلاث مرات بالماء المقطر لإزالة أي تحاليل غير مرتبطة، ثم جففه باستخدام غاز النيتروجين. بعد ذلك، قم بإجراء تخفيف بنسبة 1 إلى 1000 للأجسام المضادة لـ fluorescein والمقترنة بإنزيم HRP في محلول PBS يحتوي على Caine. ثم أضف 60 µL من تخفيف الأجسام المضادة إلى سطح القطب الكهربائي.

قم بتطبيق مجال A-C-S-W-E على سطح القطب لربط الجسم المضاد anti fluorescein HRP بمجس الكشف. اشطف سطح المستشعر ثلاث مرات بالماء المقطر لإزالة الأجسام المضادة الزائدة، ثم جفف القطب باستخدام غاز النيتروجين. بعد ذلك، ضع 60 µL من ركيزة TMB على سطح كل مستشعر باستخدام ماصة متعددة القنوات، وباستخدام مقياس الجهد الكهروكيميائي، قم بقياس تيار القطب عند -200 mV لمدة 60 ثانية.

للحصول على قراءة التثبيت، استُخدم المجهر الإلكتروني النافذ لتحديد ما إذا كانت الإكسوسومات مرتبطة بالخرزات المغناطيسية. وتتوافق الحبيبات التي يتراوح حجمها بين 70 و100 nanometer والملتصقة بالخرزات مع الحجم المعروف للإكسوسومات عند تحللها بواسطة المجال الكهربائي أو المنظف. ولا تظهر أي إكسوسومات بالقرب من الخرزات.

تم الكشف عن mRNA لـ GA DH في الإكسوسومات عن طريق قراءة atric. وتقل كمية GA DH الموجودة بمرور الوقت كما هو متوقع عند تحلل الإكسوسومات إما بواسطة المجال الكهربائي أو المنظف، مما يشير إلى التعرض للبيئة خارج الحويصلات في اللعاب. استُخدم Efim لقياس محتوى الإكسوسومات في مصل ولعاب الفئران التي حُقنت بخلايا سرطان الرئة البشرية التي تنتج علامة إكسوسومية هي human CD 63 GFP.

بعد مرور 20 يوماً، وُجدت مستويات أعلى من CD 63 GFP في كل من المصل ولعاب الفئران التي حُقنت بالخلايا السرطانية، بينما لم يظهر ذلك في الفئران التي حُقنت بالمحلول الملحي. عند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب لمس الخرز لاستخلاص كمية كافية من السائل عند غسل الخرز لضمان غسل سطح القطب الكهربائي بشكل موحد، وتحميل المناطق على القطب الكهربائي بشكل صحيح. لقد وفرت هذه التقنية، تقنية efim، تلك القدرة الحرجة غير المتوفرة سابقاً في معرفة كيف يمكن لمرض جهازي في عضو بعيد أن يطرح معلوماته ويحسبها في هذا الكيان المسمى الإكسوسومات.

كيفية وصولها إلى اللعاب، وإلى تجويف الفم لدينا، والقدرة على التقاط الإكسوسومات، وإطلاق هذه الأهداف الجزيئية، والسماح بالكشف المتزامن عن أمراض مهددة للحياة، مثل السكري، أو سرطان البنكرياس، أو غيرها من الاضطرابات التي تهدد الحياة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخلاص الإكسوسومات بسرعة من سائل حيوي، وكيفية تفريغ حمولة الإكسوسومات، وكيفية تحليل محتوى الإكسوسومات بسرعة باستخدام نظام قطب كهربائي متكامل.