ينقول ساطة دمج البلازميد الحمض النووي في المنطقة Subventricular من الفئران حديثي الولادة لتوليد نماذج جديدة من ورم أرومي دبقي

الهدف من هذا الإجراء هو إنشاء نماذج جديدة للأورام الأرومية الدبقية وفي النهاية تطوير مناهج علاجية جديدة من خلال إحداث تكوين الأورام الأرومية الدبقية التي تؤوي طفرات جينية محددة في الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء البلازميدات الينقولات أولا ، وترميز الجينات المحددة ذات الأهمية. الخطوات التالية هي تحضير البلازميدات بكاشف تعدي وحقنها في البطين الجانبي للفئران حديثي الولادة.

ثم يتم مراقبة امتصاص تطور الورم عن طريق اللمعان. عندما تصبح أكثر وفرة ، يتم التضحية بها من أجل التحليل النسيجي والكيميائي المناعي. وبالتالي ، يتم إحداث أورام أرومية دبقية جديدة ذات تغيرات جينية محددة في النوع البري أو الخلفيات الجينية المستهدفة.

يمكن دراسة هذه الأورام في الجسم الحي أو استخدامها في المختبر لتوليد خطوط خلايا جديدة قابلة للتحليل الكيميائي الحيوي وتجارب السمية الخلوية باستخدام عوامل العلاج الكيميائي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى ، مثل الحقن التقويمي لخط خلايا الورم الأرومي الدبقي ، هي أن الأورام ناتجة عن التحول الخبيث للخلايا الذاتية إلى واحد ذو كفاءة مناعية باستخدام التعديلات الجينية التي يتم اختيارها على وجه التحديد. تعيد هذه العملية إنتاج مسببات المرض البشري عن كثب وتلخص السمات النسيجية المرضية البارزة ل GBM البشري.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال الأورام العصبية ، مثل ما هي الطفرات الدافعة المسؤولة عن إحداث أنواع مختلفة من الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال ، أو الكلاسيكي ، أو ما قبل العصبي ، أو الورم العصبي لدى البالغين أو في أورام الأطفال. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج GPM منذ العلاج الكيميائي الجديد. يمكن اختبار العلاجات المناعية الإشعاعية أو مزيج منها بسرعة نسبيا في الجسم الحي أو في المختبر باستخدام هذا النموذج.

خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما ناقشت مع زميلي ، الدكتور جون في جامعة مينيسوتا ، الذي طور نموذج ورم المخ الأولي باستخدام الجمال النائم الذي ينقل التكامل بوساطة الجينات المسرطنة ، وهو مثبط للجينات المثبطة للورم في الحمض النووي الجيني المضيف. اعتقدت أن هذه المنهجية ستكون قوية جدا لدراسة تأثير الطفرات الجديدة في تطور الورم والمساعدة في تطوير علاجات مستهدفة لسرطان الدماغ قبل ثلاثة إلى أربعة أسابيع من التجربة ، قم بإعداد قفص تربية فئران مع ذكر واحد وأنثى واحدة ، بما في ذلك كوخ الإسكيمو البلاستيكي الملون لإثراء البيئة وزيادة فرص التزاوج. قم بإزالة الذكر بمجرد تأكيد الحمل ، وبعد 18 يوما من يوم التزاوج ، ابدأ في مراقبة الأنثى للولادة.

تأكد من توفر الأم البديلة في وقت قريب من الولادة. في اليوم الأول بعد الولادة ، قم بإجراء الحقن داخل البطينين. قم بإعداد محلول الحقن بواسطة علي أولا ، نقلا عن 20 ميكرولترا من مزيج الحمض النووي الذي يحتوي على التبديل على البلازميدات بتركيز نهائي قدره 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي لكل ميكرولتر.

بعد ذلك ، عند 20 ميكرولتر من محلول PEI إلى محلول الحمض النووي واتركها تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة إلى ساعة وبعد ذلك يجب تخزين المزيج على الثلج. بالنسبة لإبرة الحقن ، قم بتوصيل حقنة سعة 10 ميكرولتر بإبرة تحت الجلد قياس 30 ، مشطوفة عند 12.5 درجة. ثم قم بتوصيل المحقنة بمضخة صغيرة بالحقن التلقائي.

اختبر الإعداد ب 10 ميكرولتر من الماء وتأكد من إفراغ المحقنة. الآن ، قم بتبريد المرحلة التجسيمية لحديثي الولادة بملاط من الثلج الجاف والكحول. عندما يتم تبريده إلى ما بين درجتين وثماني درجات مئوية ، تابع الحقن.

قم أولا بتخدير الجرو عن طريق وضعه على الجليد لمدة دقيقتين. أثناء وجود الجرو على الجليد ، قم بتحميل المحقنة بمحلول الحقن. بمجرد التخدير ، انقل الجرو إلى الإطار وقم بتثبيت رأسه بين قضبان الأذن المغطاة بالشاش.

تأكد من أن الجانب الظهري للجمجمة أفقي وموازي لسطح الإطار. أيضا ، يجب أن تكون خيوط الجمجمة مرئية بوضوح. إذا لم يتم تثبيت رأس الجرو بقوة كافية ، فسوف يتحرك أثناء الحقن.

بينما إذا تم ضغطه بقوة شديدة بين قضبان الأذن في الإطار ، فلن يكون لامدا مرئيا وسيؤدي الضغط داخل الرأس إلى إجبار المحلول المحقون على التسرب مع الإمساك بالجرو بإحكام من الإطار ، امسح الرأس بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم اخفض الإبرة واضبط موضعها بحيث يتصل بلامدا. بعد ذلك ، ارفع الإبرة وحركها 0.8 ملم جانبيا و 1.5 ملليمتر. ثم اخفضه مرة أخرى حتى يغمر الجلد قليلا.

سجل إحداثيات هذا الموقف. ثم اخفض الإبرة ، 1.5 ملم عبر الجلد والجمجمة وفي القشرة عند البطين الجانبي هناك. حقن 0.75 ميكرولتر على مدار 90 ثانية ، وانتظر دقيقة للسماح للمحلول بالتشتت أثناء الانتظار.

يمكن تخدير الجرو التالي الذي سيتم حقنه. بعد الوزن ، ارفع الإبرة ببطء ، ثم انقل الجرو إلى موقع الاسترداد تحت مصباح التدفئة. يجب أن يكون الوقت من التخدير إلى الاحترار أقل من 10 دقائق.

كلما كانت أسرع مراقبة تنفسه بشكل أفضل ، وإذا لزم الأمر ، افرك الأطراف برفق لتحفيز التنفس. بمجرد تسخين الجرو ، يكون له لون وردي ونفس ثابت ، أعده إلى والدته. يستغرق هذا عادة من خمس إلى سبع دقائق من الحقن.

إذا تم حقن العديد من الجراء ، فيجب استعادتها جميعا قبل إعادة أي منها إلى الأم. إذا لم تكن جميع الجراء جاهزة بعد نصف ساعة ، فأعد نصفها إليها ثم أعد الباقي لاحقا في نهاية الإجراء ، راقب السد. بعد إعادة الجراء.

إذا لم تكن تستجيب للجراء ، أضف الأم البديلة إلى القفص. بعد 24 إلى 72 ساعة من الحقن ، راقب امتصاص البلازميد وانقل جميع الجراء إلى ستة أطباق لزراعة أنسجة الآبار جرو واحد لكل بئر. ثم قم بتحميل حقنة ملليلتر واحد مع 30 ملليغرام لكل مليلتر من لوسيفر في محلول ملحي أو PBS وإرفاق إبرة تحت الجلد قياس 30.

قم بحقن 30 ميكرولترا من المحلول تحت الجلد بين شفرات كتف كل جرو لتجنب إصابة الجرو ، وحقن المحلول تحت طية صغيرة من الجلد. انقل الجراء على الفور إلى نظام تصوير التلألؤ البيولوجي في الجسم الحي. قم بإعداد تسلسل للحصول على أربع صور متتالية على فترات دقيقة واحدة مع تعريض تلقائي وفتحة عدسة واحدة. فيما بعد.

بعد حوالي 17 يوما ، قد تبدأ في تكوين أورام عيانية يمكن اكتشافها عن طريق التلألؤ البيولوجي والنسيجة. قد يستغرق الأمر أيضا ما يصل إلى ستة أسابيع لمراقبة الأورام. حقن 100 ميكرولتر من محلول لوسيفيريان داخل الصفاق بإبرة قياس 26.

بعد ثلاث دقائق ، قم بتخدير في غرفة تخدير الأكسجين الفلوري ISO ، وضع في غرفة التصوير المزودة بأقماع لتفريق فلور ISO. احصل على سلسلة من ست صور بفواصل زمنية مدتها دقيقتان مع وقت تعريض تلقائي وتجميع متوسط وفتحة عدسة مفتوحة بفتحة عدسة F-stop واحدة. عادة ما تكون منطقة الاهتمام عبارة عن شكل بيضاوي فوق الرأس ، يتم قياس شدة اللمعان في كل باستخدام نفس الإعدادات لتوصيف السمات النسيجية المرضية للأورام الأرومية الدبقية الناجمة عن SB.

تم حقن C 57 ستة فئران سوداء حديثي الولادة في P واحد مع بلازميد وطلاء لوسيفيراز بالاشتراك مع NRA S و SV 40 بلازميدات T كبيرة ينقولات Inod مع الحمض النووي المسرطن. بدلا من ذلك ، تم حقن بلازميد يشفر دبوس شعر قصير P 53 مع PDGF beta ، ومراسل GFP بالاشتراك مع NRAS. كان النخر الكاذب واضحا كما كان حول الأوعية الدموية ومنتشرة في الدماغ.

كما تمت مراقبة الأورام الأرومية الدبقية المتني بالتلألؤ البيولوجي. عادة ما تستسلم لعبء الورم. عندما وصل التلألؤ إلى شدة من 10 إلى السابع إلى 10 إلى الوحدات التاسعة المعايرة.

كان متوسط بقاء يعتمد كما هو متوقع على مجموعات الينقولات المسرطنة التي يتم حقنها في دماغ حديثي الولادة. تم إحداث الأورام الأكثر عدوانية مع NRS و SV 40 تم تمييز أورام مستضد T الكبيرة de novo بتعبيرها عن جزيئات مميزة. عبرت الأورام الناشئة المصنوعة للتعبير عن GFP المستحث باستخدام SHP 53 و NRAS عن علامة الخلايا الجذعية العصبية neston ، وعبر بعضها أيضا عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي.

بعد 56 يوما ، تم العثور على ورم محاطا بالعديد من الخلايا النجمية الإيجابية GFAP. عبرت هذه الخلايا السرطانية عن نين ولكن ليس GFAP. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحث على تكوين الأورام الأرومية الدبقية ، وإيواء طفرات جينية محددة من خلال الحقن داخل البطينين في الفئران حديثي الولادة ، وكيفية مراقبة تطور المرض بالتلألؤ البيولوجي.

ستجد في المقالة تفاصيل حول كيفية استنساخ البلازميد الجديد بسهولة ، وترميز الجينات ذات الأهمية ، وكذلك كيفية مراقبة الأورام وتحليلها باستخدام علم الأنسجة والكيمياء المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، ستجد طريقة مفصلة حول كيفية توليد خطوط خلايا جديدة للورم الأرومي الدبقي من المصابة بأورام الهندسة الوراثية. نأمل أن تساعد هذه المقالة في تسريع اكتشاف علاجات جديدة لهذا المرض البشري المدمر.