تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا انواع معينة ايليجانس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تقييم شامل للسمية الكيميائية للسلالة الجرثومية باستخدام الديدان الخيطية C No Haitis elgan. يتم تحقيق ذلك عن طريق مزامنة الديدان أولا عن طريق إضافة محلول مبيض مخفف إلى مجموعة ديدان المرحلة المختلطة من سلالة C Elgan PXOL واحدة GFP. تولد هذه الخطوة عددا كبيرا من الأجنة المحمية من التبييض بقشر البيض.

تتمثل الخطوة الثانية في توليد مجموعة متزامنة من اليرقات L عن طريق ترك الأجنة تفقس في سائل بدون طعام. بعد ذلك ، تنمو الديدان إلى المرحلة اليرقية الرابعة أو L أربعة ، وعند هذه النقطة تتعرض للمواد الكيميائية ذات الأهمية في السائل لمدة 65 ساعة. الخطوة الأخيرة هي التصور من خلال الفحص المجهري الفلوري للتعبير عن مراسلي GFP في الأجنة داخل رحم الديدان.

في النهاية ، تعكس نسبة الأجنة الإيجابية ل GFP مقارنة بالتحكم في DMSO استعداد المركبات التي تم اختبارها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل نماذج Rodin أو فحوصات زراعة الخلايا ، هي أنه يمكننا تقييم سمية المواد الكيميائية والسلالة الجرثومية في نموذج حيواني كامل مع إجراء اختبار عالي الإنتاجية في نفس الوقت لإجراء الإجراء. اليوم ستكون زميلة ما بعد الدكتوراه الدكتورة دانييلا بيروتي.

تم إعداد الديدان الرسومية لهذا الإجراء مسبقا كما هو موضح في نص البروتوكول المصاحب ، وجمع ديدان GR من وسط نمو الديدان الخيطية أو ألواح NGM عن طريق غسلها بواحد إلى ملليلتر من M تسعة ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. دع رواسب دودة GR إلى قاع الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر لمدة خمس إلى 10 دقائق تقريبا. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات الدودية.

انقل حبيبات الدودة إلى اثنين إلى أربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة وأضف ملليلتر واحد من محلول التبييض المخفف إلى كل أنبوب. احتضن لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. راقب تقدم التفاعل تحت المجهر المجسم للتأكد من موت جميع الديدان.

لا تقم بالتبييض لمدة تزيد عن خمس دقائق حيث يمكن أن تموت الأجنة. اجمع الديدان عن طريق التسريب المركزي لمدة دقيقة واحدة. عند 3000 دورة في الدقيقة.

قم بإزالة السوبر وأضف ملليلترا واحدا من M تسعة معقمة لتحييد التفاعل. تأكد من أن جميع المواد التي تتلامس مع الديدان بعد معالجة التبييض معقمة. اغسل الديدان مرتين باستخدام M nine media.

قم بإزالة المادة الطافية وأضف M تسعة إلى 100 إلى 200 ميكرولتر. باستخدام ماصة المراعي الزجاجية ، أضف قطرة من مزيج الدودة M Nine لتنظيف ألواح NGM واحتضانها لمدة 24 ساعة على الأقل عند 20 درجة مئوية للسماح للأجنة بالفقس بدون طعام. سيتم إيقاف نمو اليرقات في المرحلة L ، خطوتان من التزامن.

يتم استخدام التبييض وتجويع الكلمات L لأنه من الأهمية بمكان تحقيق مجموعة دافئة متزامنة للغاية لزيادة عدد اليرقات الأربعة التي سيتم استخدامها للتعرض. بعد يوم واحد من إنشاء مجموعة من اليرقات L واحدة متزامنة ، اجمع اليرقات L واحدة من صفائح NGM الواضحة. اغسل الألواح بواحد إلى ملليلترين من M تسعة وانقل اليرقات L إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

دع الديدان البالغة الميتة تترسب في قاع الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر لمدة خمس دقائق تقريبا. اجمع المادة الطافية حيث توجد الديدان L one في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا. قم بترسيب الديدان عن طريق التسريب المركزي لمدة دقيقتين عند 2 ، 600 دورة في الدقيقة.

قم بإزالة المادة الطافية مع ترك ما يقرب من 500 ميكرولتر. حدد تركيز الديدان في محلول M التسعة عن طريق حساب عدد الديدان في 10 قطرات ميكرولتر. باستخدام مجهر ستيريو ، عد خمس قطرات على الأقل.

اضبط تركيز الديدان على 20 إلى 25 دودة لكل ميكرولتر في M تسعة ، ثم أضف 50 ميكرولترا من مزيج الدودة M تسعة إلى ألواح NGM. يجلس مع OP 50 ، تحتضن البكتيريا المغذية لمدة 65 ساعة عند 15 درجة مئوية للسماح للسكان المتزامنين L بالنمو حتى يصلوا إلى المرحلة الرابعة. تستخدم هذه الشاشة CL ضد السلالة التي تحتوي على مراسل نسخ فلوري للكشف عن اضطراب السلالة الجرثومية وتحريض اختلال الصيغة الصبغية الجنيني.

اجمع اليرقات الأربعة L من ألواح NGM الشفافة عن طريق غسل الألواح بواحد إلى ملليلترين من M تسعة ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. دع رواسب الدودة الأربعة L إلى قاع الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر لمدة خمس إلى 10 دقائق تقريبا. ثم قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات الدودة.

أضف ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من M تسعة وحدد تركيز الديدان في محلول M تسعة عن طريق حساب عدد الديدان في قطرات 10 ميكرولتر. باستخدام مجهر ستيريو ، عد خمس قطرات على الأقل لكل عينة. أعد تعليق الديدان بتركيز ديدان واحدة لكل مليلتر في M تسعة.

تمييع البكتيريا OP 50 المعدة مسبقا عشرة أضعاف مع M تسعة. تأكد من وصول البكتيريا المعلقة إلى درجة حرارة الغرفة لأن درجات الحرارة المنخفضة تؤثر على تطور الدودة باستخدام ماصة متعددة القنوات أولا ، أضف 100 ميكرولتر من مزيج الدودة M تسعة إلى كل بئر من صفيحة بئر دائرية عميقة سعة ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من بكتيريا OP 50 المخففة إلى كل بئر في النهاية.

سيحتوي كل بئر على 100 دودة في 500 ميكرولتر. أضف 0.5 ميكرولتر من مادة الاختبار الكيميائية إلى الآبار المرغوبة لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومولار. يعرض التركيز المستخدم بشكل شائع في الشاشات الكيميائية في CL elgan ضوابط الإيثانول أو مذيبات DMSO بتركيز نهائي قدره 0.1٪ كعنصر تحكم إيجابي.

استخدم 100 ميكرومولار بدون كوسول. ختم اللوحة باستخدام فيلم لاصق. تأكد من إغلاق اللوحة جيدا لمنع التلوث المتبادل بين الآبار.

لف اللوحة بورق الألمنيوم. انقل اللوحة إلى شاكر بدرجة الحرارة المناسبة لفترة زمنية مناسبة. حافظ على درجة حرارة الغرفة حوالي 20 درجة مئوية حيث تؤثر درجة الحرارة على نمو الديدان عند الانتهاء من التعرض الكيميائي في شاكر.

دع ألواح الآبار البالغ عددها 96 درجة ترتاح لمدة 10 إلى 15 دقيقة للسماح للديدان البالغة بالترسيب في قاع اللوحة باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بإزالة 350 ميكرولترا من M تسعة من كل بئر مع الحرص على عدم إزعاج الديدان الموجودة في الجزء السفلي من اللوحة. اغسل الديدان بملليلتر واحد من M تسعة واترك الطبق يرتاح مرة أخرى لمدة 10 إلى 15 دقيقة للسماح للديدان البالغة بالترسيب في القاع.

قم بإزالة مليلتر واحد من M تسعة من كل بئر مع الحرص الشديد على عدم إزعاج الديدان في قاع اللوحة. Resus ، الديدان في M تسعة المتبقية. اجمع 100 ميكرولتر من مزيج الدودة M تسعة من لوحة البئر 96 وقم بتحميلها في آبار لوحة البئر السفلية 384 ذات الجدار الأسود.

كرر العملية باستخدام الديدان من 4 96 لوحة بئر حتى يتم تحميل جميع آبار لوحة البئر 384. من المهم أن يكون لجميع الآبار نفس الحجم من أجل زيادة كفاءة وسرعة التركيز التلقائي أثناء عملية الحصول على الصورة. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من الليلة إلى كل بئر واترك الديدان تحتضن لمدة 30 دقيقة تقريبا.

يعمل Lale كناهض لمستقبلات الأسيتيل كولين ويشل حركة الديدان ، وينقل اللوحة إلى مجهر واسع المحتوى ، قادر على توفير التصوير الآلي. استخدم برنامجا عالي المحتوى للحصول على الصور وتحليلها وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. حدد الهدف أربعة x للحصول على صورة واحدة لكل من.

حسنا ، اضبط معلمات تصوير GFP على 45 مللي ثانية من التعريض الضوئي ودقة الصورة إلى 2160 × 2160. تبدأ الحصول على الصور يتم تصوير الديدان المكشوفة مباشرة على 384 لوحة بئر. يتم حساب عدد الديدان التي تحتوي على جنين إيجابي واحد على الأقل لكل بئر ويتم تطبيعها حسب العدد الإجمالي للديدان في ذلك البئر كما هو موضح هنا.

يؤدي التعرض لعوامل كيميائية مثل AOL السم الصغير الذي لا يحتوي على رمز إلى تحريض نسبة عالية من الأجنة التي تعبر عن GFP مقارنة بالتحكم في DMSO. الأجنة الإيجابية ل GFP أكثر إشراقا بشكل ملحوظ من مضان الخلفية الضعيف الذي لوحظ في الأجنة الأخرى ، بالإضافة إلى التألق الذاتي الذي لوحظ في أمعاء. يشير السهم الأحمر إلى الأجنة الإيجابية ل GFP المرئية بوضوح داخل رحم دودة معالجة AOL بدون رمز.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تلطيخ الحمض النووي للديدان من أجل إلقاء نظرة أكثر تفصيلا على تأثير المواد الكيميائية على السلالة الجرثومة. تسمح هذه التقنية للباحثين في مجال علم السموم بتقييم السمية التناسلية وسمية السلالة الجرثومية للمواد الكيميائية بسرعة.