باستخدام فيروس الغدة اسوشيتد كأداة لدراسة الحواجز الشبكية في مرض

الهدف العام من هذا الإجراء هو استقصاء نفاذية الحاجز الدموي الشبكي وسلامة الغشاء المحدد الداخلي في النماذج الحيوانية لأمراض الشبكية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حقن جزيئات AAV التي تحتوي على ترانزجين GFP في الجسم الزجاجي أو في مجرى الدم. والخطوة الثانية هي أخذ عينات من الدم في نقاط زمنية مختلفة بعد عمليات الحقن.

يتم استكمال عملية أخذ عينات الدم بتصوير قاع العين أسبوعياً داخل الجسم. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء الكيمياء النسيجية المناعية على العينات المسطحة للشبكية والمقاطع التجميدية للشبكية. وفي الختام، يتم استخدام المجهر البؤري وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإظهار نمط نقل المؤشر الدال على سلامة الغشاء المحدد الداخلي (ILM) والكشف عن جسيمات AAV في مجرى الدم، مما يثبت نفاذية الحاجز الدموي الشبكي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية، مقارنة بطرقنا الحالية، في أن طريقة لصق AAV توفر معلومات حول نفاذية الحاجز الدموي الشبكي لا توفرها الخلايا الأخرى. وتمتد تطبيقات هذه التقنية إلى العلاج الجيني بوساطة AAV لأنها تساعد في ضمان نفاذية الحاجز الدموي الشبكي لجزيئات AAV، مما يتجنب أي آثار جانبية غير مرغوب فيها. كما يمكن لهذه الطريقة تقديم رؤى حول سلامة الغشاء المحدد الداخلي في النماذج الحيوانية لأمراض الشبكية الأخرى مثل الجرذان المصابة بداء السكري.

لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن شبكية العين في نموذج الفأر DP 71 null الذي أظهر تحللاً في الحاجز الدموي الشبكي كانت أكثر كفاءة في عملية نقل الجينات مقارنة بشبكية العين من النوع البري.

ابدأ بتخدير فئران C-57 black-six J. تحقق من فقدان ثلاثة ردود فعل، وهي منعكس التعديل، ومنعكس السحب، والاستجابة لقرص الذيل.

يؤكد فقدان هذه المنعكسات إتمام عملية التخدير. بعد ذلك، قم بتوسيع حدقتي العين عن طريق وضع 5%neosynephrine و 0.5%mydriaticum على القرنية باستخدام قطارة. ثم استخدم مرهمًا بيطريًا لترطيب العينين لمنع جفافهما بشكل مفرط. الآن، قم بتعبئة إبرة ذات استخدام واحد فائقة الدقة بمقياس 30 بمحلول مخزون يحتوي على 1 إلى 4 مضروبة في 10¹¹ جسيم من AAV-GFP.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن عليهم إجراء حقن داخل الجسم الزجاجي بأمان تام دون لمس العدسة أو الشبكية. ثم يتم تمرير إبرة مخصصة للاستخدام مرة واحدة بقياس 30 gauge فائقة الدقة عبر خط الاستواء وبجوار اللمّـة إلى داخل التجويف الزجاجي. وبعد إدخال الإبرة في العين، يتم حقن microliter واحد من المحلول مع مراقبة الإبرة في مركز التجويف الزجاجي.

استخدم عيناً واحدة كعينة ضابطة لتجارب الغشاء المحدد الداخلي، وقم بالحقن في كلتا العينين لتجارب الحاجز الدموي الشبكي. بعد الحقن، ضع علاجاً موضعياً مضاداً للالتهابات ومضاداً للبكتيريا في كل عين محقونة. بعد مرور أسبوع واحد، قم بتوسيع حدقتين العين باستخدام neosynephrine وmydriaticum، وأجرِ فحوصات لقاع العين باستخدام كاميرا تصوير قاع العين.

تتبع تعبير GFP من خلال الملاحظات في الأسبوع الأول، والأسبوع الثاني، والشهر الأول، والشهر الثاني بعد الحقن. بعد استئصال العينين من حيوان محقون تم إخضاعه للقتل الرحيم، قم بتشريح العينين لإزالة العدسة والقرنية. ثم قم بتثبيت العين المشرحة بالغمر في 4%para formaldehyde لمدة ساعة واحدة. وبعد ساعة، قم بحماية العينين بالتبريد في 10%sucrose لمدة ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة. ثم انقع العينين في 20%sucrose لمدة ثلث ساعة في درجة حرارة الغرفة.

أخيراً، تُترك العيون في محلول sucrose بنسبة 30% طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. وفي اليوم التالي، يتم تثبيت وتجميد أكواب العين في راتنج تثبيت مثل cryo-matrix. ثم باستخدام جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat)، يتم عمل قطاعات بسمك 10 micron وتثبيتها على شرائح مُعدة للأنسجة المجمدة.

قم الآن بنفاذية المقاطع الموجودة على الشرائح باستخدام المنظف لمدة خمس دقائق. اتبع ذلك بغسلتين قصيرتين في PBS. ثم قم بحجب العيون لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بالنسبة لعينات الشبكية المسطحة (retinal flat mounts)، يُسهّل التشريح عن طريق تثبيت العيون المستأصلة في 4%para formaldehyde لمدة تتراوح بين 15 إلى 30 دقيقة. يجب إجراء عملية التثبيت هذه، وعملية التثبيت التي تلي التشريح، بشكل صحيح لأن ذلك أمر بالغ الأهمية للحفاظ على فلورة GFP. خلال فترة التثبيت التي تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة، يتم تشريح العيون وإزالة القرنية والعدسة.

افصل الشبكية عن الظهارة الصبغية للشبكية وعن الصلبة عن طريق القص حول الناتئة المسننة والعصب البصري. بعد التشريح، اغمر الشبكية في 4% Para formaldehyde لمدة 30 دقيقة أخرى لتثبيت النسيج والبروتين الفلوري في خلايا الشبكية المنقولة. بعد التثبيت، اغسل العينة لمدة خمس دقائق في PBS معقم عند pH 7.4.

بعد ذلك، استبدل محلول PBS بمحلول الحجب (blocking buffer) واحضن الشبكيات لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. ابدأ خطوة الوسم بحضن العينات مع الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب إما لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وبعد إضافة الجسم المضاد الأولي، اغسل الأنسجة ثلاث مرات بمحلول PBS، ثم احضن الأنسجة في محلول تخفيف بنسبة 1 إلى 500 من الأجسام المضادة المقترنة بـ Alexa Fluor في محلول الحجب.

يتم التحضين لمدة ساعة واحدة للمقاطع المجمدة (cryo-sections) أو ساعتين للعينات المسطحة (flat mounts). يتم ذلك في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. بعد تطبيق الأجسام المضادة الثانوية، يتم إزالتها من خلال ثلاث غسلات بمحلول PBS كما سبق.

الآن، قم بإجراء شقوق تخفيفية في الشبكية بحيث يمكن تثبيتها بشكل مسطح على شريحة زجاجية، مع توجيه إما المستقبلات الضوئية أو خلايا العقد الشبكية للأعلى. ضع وسط تثبيت مائي وغطاءً زجاجياً. يمكن تخزين الشرائح عند درجة حرارة 4 °C قبل التصوير باستخدام المجهر البؤري الماسح.

ابدأ بتوليد ضابط موجب للجزيئات الفيروسية AAV المنتشرة. أولاً، خذ عينة دم بحجم 10 إلى 20 µL قبل حقن AAV. بعد ذلك، وبمجرد التخدير، احقن 100 µL من المحلول الفيروسي المركز في مجرى الدم.

تعد الوريد القضيبي الطريقة الأسهل لحقن المواد في مجرى الدم. في هذا التسجيل المرئي، نقوم بحقن صبغة زرقاء كعامل تحكم مرئي لعملية الحققن. على مدار الأيام الثلاثة التالية، استمر في أخذ عينة دم صغيرة بشكل دوري ثم قم بتضحية الفأر. استخلص الحمض النووي الجينومي DNA من عينة نسيجية باستخدام طقم تجاري، وباستخدام DNA قم بإجراء تضخيم PCR باستخدام زوج من البادئات لـ GFP. قم بتشغيل 30 دورة مع تمديد لمدة 45 ثانية ودرجة حرارة تلدين تبلغ 55 درجة مئوية. كان من المتوقع أن يزداد نمط ترنسدكشن ناقل SHH 10 في فئران DP 71 null. إذا أظهر النموذج الحيواني اضطرابات في بنية الغشاء المحدد الداخلي، فإن فئران DP 71 null تعاني من تضرر الحواجز الشبكية، وبالتالي فهي تمثل مقارنة مفيدة؛ حيث أن الحقن داخل الزجاجي لـ SHH 10 في فئران DP 71 null يستهدف خلايا مولر الدبقية بشكل أكثر كفاءة.

يشير هذا إلى زعزعة استقرار الغشاء المحدِّد الداخلي في سلالة الفئران المعدلة وراثياً هذه مقارنة بمجموعات الضبط من النوع البري. كما أظهر حقن AAV5-GFP نفاذية الغشاء المحدِّد الداخلي أيضاً. وقد كان AAV5 غير فعال عند الحقن داخل الجسم الزجاجي في الفئران من النوع البري، ولكنه أصبح فعالاً بشكل قوي في إيصال الجينات إلى المستقبلات الضوئية في الفئران التي تعاني من خلل في الحاجز الشبكي، كما هو الحال في الفئران التي تفتقر إلى DP 71.

من خلال تحليل PCR، يظل الحاجز الدموي الشبكي في الفئران التي تفتقر إلى DP 71 انتقائياً تجاه جزيئات AAV، حيث لم يتم العثور على أي أثر لـ AAV في عينات دمها بعد الحقن داخل الجسم الزجاجي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفيروس المرتبط بالغدة (adeno associated virus) لاختبار سلامة الغشاء المحدد الداخلي أو نفاذية الحاجز الدموي الشبكي من خلال تحليل نمط ترانسدكشن الشبكية أو وجود جزيئات AAV في مجرى الدم.