المتوازية الوراثية مع نيون البروتينات للتطبيقات المضاعفة

الهدف العام من التجربة التالية هو ترميز خلايا الثدييات بالفلورسنت لتعزيز المقايسات البيولوجية المتعددة الإنتاجية العالية التي تعتمد على قراءات الفلورسنت المميزة. للقيام بذلك ، يتم استخدام جزيئات الفيروسات القهقرية للتعبير بثبات عن البروتينات الفلورية في خلايا الثدييات ، وبالتالي تشفيرها. بعد ذلك ، يتم إجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت للحصول على مجموعات مشفرة نسيلية.

ثم يتم تضخيم المجموعات النسيلة ودمجها وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي للتأكد من أنه يمكن تمييزها عن بعضها البعض وبالتالي استخدامها بشكل متزامن. أخيرا ، يتم تحويل خطوط الخلايا المشفرة باستخدام مقايسة ذات علامات مميزة. تتم مراقبة البروتينات والنشاط البيولوجي باستخدام قنوات الفلورسنت المتميزة عن القنوات المشفرة.

توضح النتائج فائدة طلاء قضيب الفلورسنت لخلايا الثدييات للتطبيقات المتعددة في بيئة عالية الإنتاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية التي تتطلب معايرة دقيقة للأجسام المضادة أو الصبغة هي أنه بمجرد إنشاء خطوط الخلايا المشفرة وراثيا ، فإنها لا تتطلب مزيدا من التلاعب ولأن البروتين محل الاهتمام يتم التعبير عنه لفترات طويلة من الزمن ، يتم استخدامها بشكل أكبر للتكيفات البيولوجية. يسمح لنا اقتران خطوط الخلايا المشفرة وراثيا الفلورية مع المقايسات السطحية بالتحقيق في الوظائف أو التأثيرات البيولوجية بشكل مستقل في تنسيق الإنتاجية المائية.

في مثالنا ، نستخدم طلاء القضيب الجيني الفلوري لمراقبة انقسام ركائز فيروسية مختلفة مضاعفة. يمكن استغلال الاختبار بشكل أكبر للتحقيق في الآليات المشاركة في الانقسام واكتشاف الأدوية عالية الإنتاجية. في اليوم السابق لإرسال الإرسال ، قم بزرع صفيحة 10 سم مع 2.5 في 10 إلى خلايا Phoenix GP السادسة في DMEM مع 10٪ FBS.

يعبر خط خلايا التعبئة هذا بثبات عن بروتينات الكمامة والقطب لتكوين جزيئات الفيروسات القهقرية في نشوة. في يوم التعدي ، استخدم مجهر المجال الساطع لفحص الخلايا. يجب أن تكون الخلايا صحية وتلتصق باللوحة في طبقة أحادية لاستخدامها في التعدين.

بعد ذلك ، قم بإعداد خليط تعداء الحمض النووي إلى 125 ميكرولتر من المصل الخالي. DMEM. أضف ثلاثة ميكروغرامات من ناقل البروتين السكري لفيروس التهاب الفم الحويصلي ، P-C-I-V-S-VG ، وثلاثة ميكروغرامات من ناقل النقل الذي يحمل جين البروتين الفلوري ذي الأهمية ، أضف 15 ميكرولترا من كاشف تعداء البولي إيثيرامين واخلطه للحصول على جزيئات فيروسية تحمل علامات بروتين فلورية مختلفة. قم بإجراء كل تعداء بشكل مستقل باستخدام العلامة التي تختارها للقيام بذلك.

احتضان كل خليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة بعد الحضانة عن طريق إضافة الخليط إلى الخلايا. ثم تحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية. اختياريا ، بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط بسبعة ملليلتر من الوسط الطازج.

على الرغم من أن هذا قد يحسن صحة الخلية ، إلا أنه قد يقلل من الحمل الفيروسي في المادة الطافية. بعد 48 ساعة من التعدي ، استخدم ماصة لنقل المادة الطافية ، التي تحتوي على جزيئات الفيروس إلى حقنة سعة 10 مل. مزود بفلتر بولي تترافلورو إيثيلين 0.20 ميكرومولار للضغط على المكبس لتوزيع المرشح في أنبوبين من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المليلتر.

ضع جانبا كمية ملليلترة للاستخدام الفوري. ضع القطع الفيروسي المتبقي والحصص على الجليد وانقلها إلى سالب 80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها قبل 24 ساعة من التحويل في كل بئر من ستة بئر بذرة 2.0 إلى 3.0 مرات 10 إلى الخلايا الملتصقة الخامسة هنا يتم استخدام 2 9 3 خلايا T في اليوم التالي. لتحويل الخلايا الملتصقة ، قم بإزالة الوسائط الموجودة من اللوحة.

أضف خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من الدماغ المتعدد إلى ملليلترين من الجيب الفيروسي الذي تم جمعه مسبقا ، وأضف الخليط بعناية إلى الخلايا. ختم اللوحات مع عطر. ثم ضع الأطباق في دلو معلق.

أجهزة الطرد المركزي بأجهزة الطرد المركزي عند 1500 مرة G لمدة 120 دقيقة عند 32 درجة مئوية. بعد الدوران ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة ، استبدل الخلايا المتوسطة لمدة 72 ساعة على الأقل.

ما بعد التنبيغ. استعد لتحليل الخلايا المنقولة عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية لمعدل التنبيغ. أولا ، باستخدام خط خلية غير محول قابل للمقارنة كعنصر تحكم سلبي ، تأكد من ضبط البوابات بشكل صحيح في القنوات الصحيحة.

اضبط جهد قناة المعلمة بحيث يكون السكان السالبون أقل من قيمة 10 إلى الثلث على كل محور فلوري محل اهتمام. بعد ذلك ، قم بتعيين بوابات التألق الإيجابي كأحداث تظهر خارج نطاق التحكم السلبي. ثم باستخدام الخلايا المحولة ، حدد النسبة المئوية الإيجابية لقناة الفلورسنت المحددة.

قم بفرز الخلايا إلى أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلتر تحتوي على مليلتر واحد من FBS بنسبة 100٪. ثم قم بتدوير المجموعات المصنفة في دلو معلق. جهاز طرد مركزي دوار عند 524 مرة G عند 32 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد الدوران ، أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من الوسط الطازج ، ثم قم بالبذور مرتين في 10 إلى الخلايا الست في ملليلترين من DMEM على صفيحة ستة سنتيمترات. عند هذا التركيز ، يكون التقاء أقل من 60٪ وسيسمح بالنمو والانقسام لمدة يومين على الأقل. ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية لعدة أيام لإتاحة الوقت للتضخيم.

يمكن إنشاء مجموعات نسيلة إما من الخلايا التي تم تحويلها في الأصل أو من الخلايا التي تم فرزها. يضمن فرز المجموعات السكانية الضيقة بناء على التألق المختار بدلا من المستنسخة الفردية في هذه المرحلة مجموعة احتياطية للاختيار المستقبلي. إذا لزم الأمر ، اضبط البوابات للفرز وفقا للمجموعات السكانية ذات الأهمية ، وتأكد من تعيين البوابات على بعد مقياس سجل واحد على الأقل للحصول على مجموعات مميزة باستخدام وحدة ترسيب الخلية الآلي ، قم بفرز الخلايا المفردة إلى 96 لوحة بئر ، لاحظ أنه سيكون هناك في المتوسط خلية واحدة لكل بئر.

قد لا تحتوي بعض الآبار على أي خلايا والبعض الآخر قد يحتوي على أكثر من متابعة. الفرز ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين على الأقل لتضخيم المستنسخة الفردية. افحص الخلايا بانتظام تحت المجهر للتأكد من أن الأعداد المتزايدة تنشأ من خلايا فردية وليس من أكثر من خلية واحدة.

تأكد أيضا من أن الخلايا لا تتضخم بعد مرور أسبوعين. قم بفحص التجمعات النسيلة المفترضة عن طريق قياس التدفق الخلوي ومقارنتها بمجموعة تحكم سلبية. يجب أن يكون للمجموعات النسيلة الحقيقية أنماط مضان ضيقة للغاية.

اختر المجموعات السكانية الأكثر تميزا بناء على متوسط كثافة السكان وضيقهم. قم بتضخيمها حسب الحاجة أو قم بتخزين المخزونات في وسط تجميد مع 10٪ DMSO عند سالب 80 درجة مئوية لفترات قصيرة من الزمن أو النيتروجين السائل لفترة أطول. بعد ذلك ، لاختبار ما إذا كان يمكن استخدام المجموعات النسيلة بنجاح في نظام فحص متعدد الإنتاجية العالي.

اختر مجموعة من المستنسخة ذات الامتصاص المميز وأطياف الانبعاث و / أو الشدة المختلفة ، واجمعها في بذرة أنبوب واحد. 50،000 من الخلايا المدمجة في 200 ميكرولتر من DMEM المكمل في كل بئر من صفيحة بئر 96 في أنابيب منفصلة. قم بإعداد عناصر تحكم سالبة ومفردة اللون لاستخدامها في إعداد المعلمات وقيم التعويض في مقياس التدفق الخلوي.

قم بتعيين قيم التعويض. ثم قم بتحليل العينة للتأكد من أنه يمكن تمييز كل خط من خطوط الخلايا الفلورية المستقلة. لتكييف خطوط الخلايا المشفرة مع تطبيق بيولوجي ، حدد أولا عناصر الفحص التي تم تصميمها بحيث تقترن بعلامة أو بروتين فلوري كاندماج أو من خلال موقع دخول داخلي للريبوسوم.

Ires ، والذي يتيح الكشف المباشر من خلال قياس التدفق الخلوي الغربي أو الفحص المجهري. يتكون النظام المستخدم هنا من اختبار بيولوجي يتم فيه التعبير عن بروتين غلاف فيروس نقص المناعة البشرية على سطح الخلية ، مما يكشف عن علامات HA والعلم. يتم التعبير عن بروتين الفحص في خلية مشفرة تعبر عن طماطم TD.

يمكن مراقبة انقسام البروتين عن طريق تلطيخه بجسم مضاد مضاد مضاد للعلم يسمى FSE. عندما لا يتم شق البروتين ، يظهر التلوين ، ولكن عندما يتم شق البروتين ، لم يعد وضع العلامات المضان الأخضر واضحا. لإنشاء الفحص البيولوجي في الخلايا المشفرة ، قم بتحويلها بجزيئات فيروسية تحتوي على عناصر الفحص المختارة.

أضف SUP natin الفيروسي إلى الخلايا التي تختارها وتدور عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بأجسام مضادة مضادة ل HA مصنفة فلورسنت. ثم قم بفرز الخلايا المشفرة لعزل تلك التي تحتوي على عناصر الفحص الإيجابية لهكتار.

أخيرا ، تم الجمع بين خطوط الخلايا المشفرة المتميزة. يحتوي كل منها على اختبار يحمل ركيزة مختلفة. احتضان خليط الخلايا بالجسم المضاد المترافق Anti-Flag و ZI وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد ما إذا كان انقسام البروتين قد حدث لتتبع الفحص أو تحليل أو فك تشفير السكان في القناة المناسبة حيث يمكن تمييز خطوط الخلايا المشفرة وراثيا المميزة هنا.

ثم تقوم قناة PE لطماطم TD بفك تشفير طبيعة الركيزة عن طريق التحليل في قناة fite للكشف عن المجموعة الإيجابية لفحص انقسام البروتينات المعبر عنها على السطح في المسار الإفرازي. خلايا فرعية T واحدة للترميز الفلوري للتعبير عن طماطم TD وفرزها إلى ثلاثة مجموعات بكثافة مختلفة. ثم تم نقل كل مجموعة من السكان بفيروس قهقري مختلف للحث على التعبير عن بروتين غلاف فيروس نقص المناعة البشرية من النوع البري أو بروتين غلاف فيروس نقص المناعة البشرية المتحور أو فيروس حمى الضنك.

بروتين حدود PRM ، كل منها محاط بعلامات العلم وHA. تم تحضين الخلايا المنقولة بأجسام مضادة مضادة ل HA و Anti-Flag. تم إجراء تلطيخ مضاد لحمض الهيالورونيك لتأكيد وجود بروتين الفحص المصمم هندسيا بينما تم إجراء تلطيخ مضاد للعلم لتحديد ما إذا كان قد انشق.

عندما تم تحليل المجموعات السكانية المجمعة غير الملوثة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، كان من الممكن تمييز التجمعات النسيلة بناء على الباركود TD للطماطم ، ولكن لا يمكن تمييز قناة fite. في المقابل ، عندما تم تلطيخ نفس السكان بجسم مضاد للعلم ، كانت مجموعة سكانية إيجابية ل flagg. بناء على الترميز الشريطي ، يمكن بسهولة تحديد هذه المجموعة على أنها مجموعة سكانية تحمل الركيزة المطافرة لفيروس نقص المناعة البشرية.

الآن ، يجب أن يكون لديك فهم جيد جدا لكيفية استخدام تقنية الصمام الرجعي جنبا إلى جنب مع قياس التدفق الخلوي. من أجل إنشاء خطوط خلايا مشفرة وراثيا الفلورية ، أربعة تطبيقات بيولوجية بتنسيق متعدد الإرسال ، والقدرة على إقران الخلايا المشفرة وراثيا الفلورية مع المقايسات القائمة على الخلايا في شكل متعدد الإرسال تعزز بشكل كبير قدرات الإنتاجية العالية. بعد إنشاء خطوط الخلايا ، من المهم تجميدها.

ثم قم بإذابتها بشكل دوري وإعادة تحليلها وتحريرها مرة أخرى. في حين أن توليد خطوط الخلايا المشفرة وراثيا الفلورية قد يستغرق وقتا طويلا في البداية ، بمجرد إنشائها ، فإنها تعزز بشكل كبير قابلية التكرار والمتانة للتطبيقات المستقبلية.