توصيف وظيفي نا ⁺ / H ⁺ المبادلات بين الخلايا من المقصورات عن طريق بروتون-مما أسفر عن مقتل اختيار للتعبير عنها في غشاء البلازما

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس نشاط مبادلات بروتون الصوديوم المعبر عنها داخل الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق اختيار الخلايا التي تعبر عن مبادلات بروتون الصوديوم داخل الخلايا في غشاء البلازما عن طريق اختيار قتل البروتون. كخطوة ثانية ، يتم تحمض الخلايا المختارة ، ثم يتم قياس استرداد الأس الهيدروجيني داخل الخلايا لتأكيد نشاط تبادل بروتون الصوديوم للخلايا.

ثم يتم قياس الحركية السريعة لنقل الأيونات لتحديد ثوابت التقارب للكاتيون والمثبطات المنقولة. في النهاية ، تسمح مراقبة التغيرات في درجة الحموضة داخل الخلايا والحركية السريعة للخلايا الجسدية المختارة بالتوصيف الوظيفي لتبادل البروتين داخل الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التعبير عن الناقلات الطافرة أو استخدام كل خلية ، هي أنها تمكن من التعبير عن الناقلات داخل الخلايا من النوع الأبيض في غشاء البلازما مما يجعل من الممكن قياس وظيفتها مباشرة.

سيوضح الإجراء الدكتور مالوري ، شاعر ، عالم أبحاث من مختبري لبدء إجراء قتل البروتونات. أولا ، احتضان الخلايا التي تعبر عن مبادل بروتون الصوديوم داخل الخلايا ذي الأهمية في تحميل المحلول عند 37 درجة مئوية وحاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بشفط محلول التحميل واغسل الخلايا مرتين بوسط جديد.

بعد الغسيل الثاني ، قم بشفط الوسط واحتضان الخلايا في محلول الاسترداد في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون. بعد ساعة أخرى ، استبدل وسط الاسترداد بوسط زراعة منتظم وقم بتنمية الخلايا في ظل ظروف الاستزراع القياسية. كرر دورة الاختيار هذه مرتين في الأسبوع حتى تظهر المستنسخة المستقرة لتصوير درجة الحموضة الفلورية داخل الخلايا للخلايا.

تم تجهيز مجموعة تصوير تتكون أولا من مجهر مقلوب مقترن بكاميرا فيديو عالية الحساسية مع مرشحات تداخل ضيقة النطاق 450 نانومتر و 490 نانومتر مقترنة بمرشحات الكوارتز ذات الكثافة المحايدة المناسبة للإثارة. إذا أمكن ، استخدم المجموعة المناسبة من المرشحات وظروف الإضاءة لإعداد قيم مضان قابلة للمقارنة للقناتين الأولى والثانية بحيث تقترب النسبة من واحد لقياس النشاط الأمامي لمبادل بروتون الصوديوم. بعد ذلك ، قم بتحمض الخلايا بحضانة لمدة ساعة واحدة في محلول تحميل الأمونيوم.

في حالة عدم وجود ثاني أكسيد الكربون خلال الدقائق الخمس الأخيرة من الحضانة ، تموت الخلايا ذات النسبة المترية الحساسة لدرجة الحموضة. في نهاية فترة الحضانة ، قم بتنظيف الخلايا بمحلول تحميل الأمونيوم للتخلص من المسبار خارج الخلية وتركيب الخلايا المصبوغة على المجهر. حدد مناطق الاهتمام حيث سيتم قياس قيم الفلورسنت حسب الاقتضاء.

ثم سجل عدة صور لإنشاء خط أساس وبث الخلايا بمحلول RIN لبدء انخفاض في التألق. بعد استقرار الرقم الهيدروجيني ، اطلع على الخلايا بالمحلول محل الاهتمام لقياس معدلات استرداد الأس الهيدروجيني بوساطة هيدروجين الليثيوم أو هيدروجين الصوديوم أو تبادل هيدروجين البوتاسيوم. الآن اطلع على الخلايا بمحلول الهيبيين المكمل بكلوريد البوتاسيوم والجيرين.

ثم اجمع قياسات التألق من الصور وقم بتصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات بتنسيق نصي لقياس المعدل الأولي لمبادل بروتون الصوديوم. سبعة ، عن طريق امتصاص الليثيوم السريع ، تحمض الخلايا والألواح متعددة الآبار بواسطة تقنية تحميل Imodium كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، اشطف الأطباق مرتين بسرعة كما هو موضح للتو.

ثم احتضان الخلايا في محاليل امتصاص تحتوي على واحد إلى 10 ميكرومولار من الليثيوم والتركيزات المطلوبة من الكاتيون أو المثبطات ذات الأهمية لمدة دقيقة واحدة أو أقل في نهاية فترة الامتصاص ، وقم بإزالة وسط الامتصاص بعناية وغسل الخلايا بسرعة أربع مرات باستخدام PBS المثلج البارد في أقل من 10 ثوان إجمالا لمنع تدفق الليثيوم ثم قم بتجميع الخلايا في 250 ميكرولتر من 25٪ حمض النيتريك لكل حسنا لمدة ساعة واحدة على الأقل. كشط كل بئر بنهاية طرف الماصة في نهاية الحضانة ونقل المعلقات من كل بئر إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة. أخيرا ، عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 15،000 جم في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحطام الخلوي ثم قياس محتوى الليثيوم في snat عن طريق التحليل الطيفي للامتصاص الذري.

وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، يعتمد اختيار قتل البروتون على انتشار قاعدة الأمونيوم الضعيفة. على سبيل المثال ، لا تستطيع الخلايا التي لا تعبر عن مبادل بروتون الصوديوم الوظيفي في غشاء البلازما استعادة قيمة الأس الهيدروجيني المحايدة ، وبالتالي تظهر جانبا محمضا نموذجيا بشكل مسطح وعصار خلوي حبيبي كما هو موضح في هذه الصورة التمثيلية بعد دورات الاختيار المتكررة ، وهي خلايا تعيش بشكل كامل ومستقر. ومع ذلك ، فإن التحمض يشكل استنساخا خلويا فرديا كما هو موضح هنا ، كما هو موضح ، يمكن تمييز النشاط وانتقائية الأيونات لمبادلات بروتون الصوديوم داخل الخلايا المعبر عنها في غشاء البلازما من خلال قياس التغيرات في الأس الهيدروجيني داخل الخلايا المستحثة في ظل ظروف تجريبية مختلفة كما لوحظ في هذه الرسوم البيانية بعد تحمض تحميل Imodium.

أما بالنسبة لحركية الإنزيم ، فيمكن استخدام استجابة الجرعة لمعدلات الامتصاص الأولية لاشتقاق قيم ثابت التقارب للركائز وقيم ثابت التثبيط للمثبطات. في الواقع ، من السمات المثيرة للاهتمام للناقلات أن كاتيون الاقتران المختلف سيتنافس على النقل ، مما يؤدي إلى إمكانية قياس ثابت التقارب للصوديوم من خلال المنافسة مع امتصاص الليثيوم كما هو موضح في هذا الشكل بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء تجارب أخرى مثل سطح الخلية BioInnovation إلى جانب إسكات الحمض النووي الريبي من أجل التحقق من أن الناقل محل الاهتمام قد تم التعبير عنه بالفعل في غشاء البلازما.