جيل من الفئران القلب منظم ضربات القلب المجاميع خلية استنادا ES-الخلوي البرمجة في الجمع مع Myh6-المروج-اختيار

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا عقدية جيبية عالية النقاء. يتم تحقيق ذلك عن طريق إحداث تمايز الخلايا أولا عن طريق تعديل الوسط وعمل قطرات معلقة تؤدي إلى تكوين أجسام جنينية بحجم محدد. بعد ذلك ، تجلس الأجسام الجنينية على طبق مغطى بالجيلاتين بحيث تشكل طبقة خلوية.

ثم يبدأ اختيار المضادات الحيوية وتبقى خلايا عضلة القلب فقط. أخيرا ، يتم فصل طبقة الخلية للحصول على خلايا عقدية جيبية مفردة سريعة الضرب ، أو أجسام عقدية جيبية صغيرة. في النهاية ، يتم استخدام تصوير الخلايا الحية لإظهار ترددات الضرب العالية للخلايا العقدية الجيبية.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكنك إنتاج خلايا عقدية جيبية عالية النقاء ، على سبيل المثال ، لاختبار المخدرات. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مرض العقدة الجيبية لأن الخلايا ستعطينا نظرة ثاقبة حول الآليات الأساسية. سيتم تقديم التكنولوجيا في المختبر من قبل جوليا يونغ ، طالبة الدكتوراه لدينا التي طورت الطريقة ، بدءا من خط الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية والخلايا الجذعية متعددة القدرات المزروعة بالاشتراك مع الخلايا المغذية المشعة كما هو موضح في بروتوكول النص قبل يومين من إجراء التمايز ، أزال PSCs من الخلايا المغذية عن طريق شفط الوسط أولا.

استخدم 10 مل من PBS لغسل الخلايا. ثم أضف سبعة ملليلتر من محلول الكولاجيناز الرابع واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، ضع مرشحا معقما بحجم 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل.

ثم اشطف مستعمرات PSC بعناية عن طريق سحب محلول الكولاجيناز لأعلى ولأسفل خمس مرات. انقل تعليق الخلية إلى الفلتر واستخدم ثمانية ملليلتر من PBS لشطف الفلتر ثلاث مرات. ثم اقلب الفلتر وضعه رأسا على عقب في طبق بتري وماصة 10 مل من PBS في الجزء السفلي من الفلتر.

لإزالة مستعمرات PSC ، انقل الآن تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 300 مرة. قم بإزالة PBS ، وقم بتعليق الخلايا في مليلتر واحد من Accutane واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، أضف 10 مل من PBS.

امزج محلول الخلية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات وجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 300 مرة G.بمجرد إزالة PBS ، استخدم 10 مل من وسط زراعة الخلايا لإعادة تعليق الخلايا وتحديد عدد الخلايا البذور. 15 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع في قارورة مرشح مساحتها 75 سم مربع وزراعتها لمدة يومين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون عندما يجب أن تكون القارورة 50 إلى 70٪ متقاربة. بعد حصاد الخلايا وتعليق Resus في وسط التمايز وفقا لبروتوكول النص ، قم بتقطيع 20 مل من الماء وخمسة ملليلتر من القطرة المعلقة أو محلول HD في طبق بتري تربيعي لتجنب جفاف hds.

بعد ذلك ، قم بتعبئة ما يصل إلى 50 مل من تعليق الخلية في صينية. ثم اقلب غطاء طبق بتري وباستخدام ماصة 12 قناة ، ضع 180 HDS يحتوي كل منها على 20 ميكرولترا من تعليق الخلية على الغطاء. اقلب الغطاء بحذر وضعه على طبق بتري.

بعد الحضانة لمدة يومين للسماح للخلايا بتكوين ebs ، اقلب بعناية غطاء طبق بتري التربيعي ونقل EBS المشتق من طبقين من بتري إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا. انتظر 10 دقائق للسماح ل EBS بالاستقرار في قاع الأنبوب ، ثم استنشق أكبر قدر ممكن من المتوسط. استخدم 10 مل من وسط التمايز لتعليق EBS ونقل التعليق إلى طبق بتري 10 سم.

بمجرد أن يتم زراعة الخلايا في تعليق لمدة أربعة أيام ، وفقا لبروتوكول النص ، انقل EBS إلى طبق ثقافة خلية واحد مطلي بالجيلاتين بمساحة 10 سنتيمترات مربعة واحتضانه خلال اليومين إلى الستة أيام التالية تحت المجهر ، وتحقق من الخلايا بحثا عن بؤر الضرب وتكوين طبقة خلية بعد ثلاثة أيام من بدء الخلايا في الضرب ، استنشق الوسط وأضف 10 ملليلتر من التمايز الطازج. وسط يحتوي على 400 ميكروغرام لكل مليلتر من G أربعة 18 للخلايا بعد أربعة أيام. قم بإزالة الوسط بعناية دون شفط طبقة الخلية.

ثم أضف 10 مل من PBS لغسل الخلايا. بعد إزالة PBS بعناية ، أضف 10 ملليلتر من محلول الكولاجيناز الرابع وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 مل. بعد ذلك ، بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، امزج المعلق بقوة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 10 مرات واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق إضافية.

يجب أن يكون هناك تعليق للعناقيد الصغيرة. ثم أضف 20 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 300 مرة. G ، استنشق PBS بعناية ، وإذا ولدت أجساما أو سيفات سينينية مستحثة ، استخدم 12 مل من وسط التمايز الذي يحتوي على 400 ميكروغرام لكل مليلتر من G أربعة 18 إلى Resus ، وقم بتعليق الخلايا وشاهد ملليلترين لكل منهما ستة آبار من صفيحة مطلية بالجيلاتين 24 جيدا لتوليد خلايا عقدية مفردة بدلا من إضافة وسط تمايز.

بعد إزالة PBS ، استخدم خمسة ملليلتر من Accutane لتعليق الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. الماصة لأعلى ولأسفل بقوة. اخلطي المعلق بعد الحضانة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

أضف 20 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 300 مرة G مع 12 مل من التمايز. متوسط يحتوي على G four 18. قم بتعليق الخلايا وشاهد ملليلترين لكل منهما على ستة آبار من 24 بئر مزرعة صفيحة مغلفة بالجيلاتين وقم بإجراء تحليل للخلايا وفقا لبروتوكول النص.

باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو ، يمكن إنشاء isab S من الخلايا الجذعية متعددة القدرات بتردد ضرب يبلغ حوالي 450 نبضة في الدقيقة كما هو موضح هنا بعد تفكك isab S. تظهر الخلايا المفردة المرصودة الأشكال النموذجية لخلايا العقدة الجيبية التي تشمل المغزل وخلايا العنكبوت. تظهر هذه الخلايا مستويات عالية من التعبير عن البروتينات الضرورية لوظيفة عقدة الجيوب الأنفية مثل فرط الاستقطاب المنشط بالنيوكليوتيدات الدورية المسورة. القناة الرابعة HCN أربعة ، التوافق أربعة خمسة conexion 30.2 و MYH ستة.

عند معالجتها باستخدام مانع القناة ZD 7 2 88 ، أو ناهض المستقبلات المسكارينية caracol ، تظهر الخلايا المشتقة من isab تردد ضرب منخفض بشكل كبير. من ناحية أخرى ، يؤدي إيزوبرين ناهض مستقبلات الغدة الكظرية بيتا إلى ارتفاع وتيرة الضرب. بشكل عام ، ستمهد تقنيتنا الطريق لفهم وظائف جهاز تنظيم ضربات القلب وأمراضه بشكل أفضل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد خلايا عقدية جيبية تعمل بكامل طاقتها من الخلايا الجذعية القوية لمنظمة PLU.