ثلاثي الأبعاد نموذج المشارك الثقافة ل-ورم انسجة التفاعل

الهدف العام من هذا الإجراء هو استقصاء التفاعلات الخلوية بين خلايا سرطان الرئة والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان باستخدام طريقة الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد. ويتم تحقيق ذلك من خلال الزراعة الأولية للخلايا الليفية المرتبطة بسرطان الرئة البشرية والمستخلصة من أنسجة الرئة المجمعة والتي يتم تقطيعها إلى قطع بحجم واحد مليمتر. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضير هلامات الكولاجين المدمجة بالخلايا الليفية عن طريق خلط محلول الكولاجين باستخدام الخلايا المعالجة بالتريبسين، ثم نقل الخليط إلى طبق مكون من ستة آبار ليتحول إلى هلام.

بعد ذلك، تُزرع خلايا سرطان الرئة الغدية على سطح كل هلام لإعداد مستنبت مشترك ثلاثي الأبعاد من الخلايا السرطانية والأرومات الليفية، ويُفصل الهلام عن حافة البئر لإنشاء مستنبت عائم. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء مستنبت الواجهة بين الهواء والسائل واختبار الغزو عن طريق تعريض الهلامات المنكمشة للهواء بوضعها على شبكة موجودة في طبق ذي ست آبار. وفي الختام، تُستخدم الفحوصات النسيجية لتقييم غزو الخلايا السرطانية والتغيرات المورفولوجية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذا الإجراء مقارنة بالطرق الحالية، مثل زراعة الطبقة الواحدة ثنائية الأبعاد، في إمكانية دراسة التفاعلات متعددة الخلايا في ظروف زراعة ثلاثية الأبعاد. يبدأ هذا الإجراء بالزراعة الأولية للخلايا الليفية من أنسجة الرئة التي تم جمعها، كما هو موضح ومشار إليه في البروتوكول النصي. وفي هذا الفيديو، تم استخدام رئات الفئران بدلاً من أنسجة سرطان الرئة البشرية.

ضع عينة نسيج الرئة في طبق زراعة أنسجة بحجم 10 سنتيمتر دون وجود وسط زراعي. قم بتقطيع النسيج إلى أقسام صغيرة يبلغ حجمها حوالي واحد مليمتر باستخدام ملقط معقم ومشرط. خلال هذه العملية، تجنب جفاف المقطع، وإلا ستتأثر كفاءة نمو الخلايا. ضع أقسام نسيج الرئة الصغيرة متباعدة عن بعضها البعض للحفاظ على منطقة فارغة تحيط بكل قطعة.

قم بإحداث خدوش على سطح طبق زراعة الأنسجة باستخدام شفرة المشرط. بدلاً من ذلك، فإن تغطية قطع الأنسجة تعزز من كفاءة نمو الخلايا وتكاثرها بعد عدة ممرات. أولاً، ضع شحم السيليكون في نقطتين، تفصل بينهما مسافة 1.5 centimeter في كل بئر.

بعد ذلك، ضع قطع الأنسجة المفرومة بشكل فردي في مركز كل بئر. ثم قم بتثبيت غطاء الساحة (cover slip) على سطح الطبق باستخدام شحم السيليكون. أضف الوسط الزرعي برفق إلى الطبق، أو إلى طبق الستة آبار، قبل أن تجف مقاطع الأنسجة.

يُفقد النمو الخلوي الفعال في معظمه. في حالة جفاف العينات، لا تسكب الوسط الغذائي بسرعة كبيرة لتجنب انفصال المقاطع النسيجية المخصصة لتكوين هلام الكولاجين. اغسل الخلايا الليفية بمحلول ملحي منظم بالفوسفات بتركيز 1x أو PBS، ثم أضف التريبسين لفصل الخلايا النامية بعد عملية التريبسين لمدة خمس دقائق تقريبًا.

عند درجة حرارة 37 °C، قم بفصل الخلايا باستخدام 9 mL من وسط DMEM المكمل بـ 10% FBS، واجمع الخلايا المعلقة في الوسط في أنبوب سعة 10 mL، ثم قم بطردها مركزياً بسرعة 200 إلى 300 ×g لتكوين كرات خلوية. أعد تعليق الكرات الناتجة في 100% FBS بكثافة نصف مليون خلية لكل mL. قم بتبريد الكواشف والماصات والأنابيب الخاصة بتحضير هلام الكولاجين في الثلاجة قبل البدء في تحضير هلام الكولاجين.

بعد ذلك، قم بتحضير هلام الكولاجين عن طريق خلط معلق الخلايا الليفية في كولاجين من النوع الأول بـ FBS و5X-DMEM ومنظم إعادة التكوين بقوة باستخدام الماصة لضمان الحصول على خليط متجانس، مع تجنب تكوين الفقاعات أثناء عملية السحب بالماصة. ثم أضف 3 mL من الخليط إلى كل بئر من أطباق الزرع ذات الـ 6 آبار، واتركها لتتجلط في الحاضنة عند 37 °C دون تحريك لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة. وبالنسبة لزراعة الخلايا السرطانية على هلام الكولاجين، قم بإعادة تعليق الخلايا السرطانية في وسط الزراعة المشتركة ثلاثي الأبعاد بكثافة 1×10⁵ خلية/mL.

صُب مليليترين من محلول خلايا سرطان الرئة الغدّي A549 المعاد تعليقه على سطح كل هلام. قم بتعديل عدد الخلايا السرطانية أو الخلايا الليفية في المزرعة المشتركة بناءً على الظروف التجريبية لإجراء انكماش الهلام. يتم تحضين الهلام طوال الليل عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا السرطانية بالالتصاق بهلام الكولاجين.

بعد ذلك، قم بفصل كل منها وإنشاء مستنبت عائم في كل بئر. في طبق الستة آبار، استخدم إبرة عيار 21 مائلة أو ملعقة صغيرة لفصل كل هلام عن حافة البئر كل يومين إلى ثلاثة أيام. قم بتجديد الوسط في الآبار بإضافة 2 mL من وسط الزراعة المشتركة ثلاثي الأبعاد (3D co-culture medium).

قُم بقياس حجم كل هلام يومياً لمدة خمسة أيام. وأخيراً، راجع البروتوكول النصي لتحليل هلام الكولاجين. يتم ذلك بعد زراعة هلامات الكولاجين عند 37 °C لمدة خمسة أيام.

عرّض الهلامات المنكمشة للهواء عن طريق وضعها على شبكة. في أطباق جديدة ذات ستة آبار، يتم صنع الشبكة من مصافي الخلايا المتاحة تجارياً والمستخدمة في قياس التدفق الخلوي. املأ كل بئر برفق بـ 11 milliliters من وسط الزراعة المشتركة ثلاثي الأبعاد (3D co-culture Medium).

ضع الهلاميات على الشبكة باستخدام ملعقة معقمة، وقم بإزالة أي وسط متبقٍ من الهلاميات في هذه الحالة. تُغمر الهلاميات في الوسط بينما يظل السطح العلوي للهلام معرضاً للهواء. تُعرَف حالة الزرع هذه بأنها الواجهة بين الهواء والسائل.

تعد طريقة الزراعة المشتركة هذه، والتي تحاكي البيئة الدقيقة للأورام، أداة مفيدة لدراسة التفاعلات بين الخلايا السرطانية والأرومات الليفية المدمجة في هلامات الكولاجين. تمت زراعة خلايا 5 49 بشكل مشترك على هلام كولاجين مدمج بالأرومات الليفية، كما عُرِضت طبقة خلايا 5 49 للهواء عن طريق وضع الهلام فوق شبكة في الوسط الغذائي. تظهر هنا صورة تمثيلية للهلام الموضوع على الشبكة في بئر من طبق ذي ستة آبار، مع التحاليل النسيجية باستخدام صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين.

كشف صبغ المقاطع العرضية لهلام مستزرع ثلاثي الأبعاد عن غزو لخلايا 5 49 داخل هلام الكولاجين المدمج مع أرومات ليفية مرتبطة بسرطان الرئة. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التعبير الجيني أو التعطيل الجيني للإجابة على أسئلة إضافية مثل وظيفة جين معين في التفاعل بين الورم والسداة.