تتبع الماوس نخاع العظم وحيدات في فيفو

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور تهريب الخلايا الأحادية في نخاع عظم الجمجمة للفأر الحي باستخدام تصوير الفوتونين. أولا ، يتم تخدير الفأر وحقنه بمحلول من العفن ، الكرم ديكستران لتسمية الأوعية الدموية. ثم يتم وضع الفأر في دعامة معدنية مخصصة ، وتتم إزالة فروة الرأس من الجزء الخلفي من العظم الجداري إلى العظم الأمامي.

ثم يتم وضع حلقة مطاطية مباشرة على الجمجمة بالغراء الجراحي والخزانات المملوءة بالمحلول الملحي السائل. أخيرا ، يتم استخدام الفحص المجهري متعدد الفوتون لتتبع تطور الخلايا الفلورية بمرور الوقت داخل نخاع عظم الجمجمة. يمكن أن يساعد هذا في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال أمراض الدم المناعية ، مثل آلية تعبئة الخلايا الوحيدة في حالة مستقرة أو بعد العلاج الكيميائي.

لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لسلوك الخلايا الوحيدة المعيارية. يمكن أيضا تطبيقه لدراسة مجموعات فرعية أخرى من خلايا نخاع العظم اعتمادا على خصوصية مراسل الأنفلونزا المستخدم. يستخدم البروتوكول التالي مجهرا متعدد الفوتون مقترنا بليزر بلوري من التيتانيوم الياقوتي ، ومغير مرجع للتحكم في طاقة الليزر.

لتمكين التسجيل المتزامن لثلاث قنوات فلورية ، يجب أن يشتمل التكوين على ثلاثة كاشفات مسح ضوئي خارجية غير DS أو nds مع مزيج من 565 نانومتر و 690 نانومتر مرايا ثنائية اللون 565 و 610 نانومتر و 500 550 نانومتر ، ومرشاح تمرير قصير 485. لاحظ أنه في هذا الإعداد ، يتم اكتشاف الجيل التوافقي الثاني أو SHG والبروتين الفلوري السماوي أو CFP بواسطة NDD بعد مرشح التمرير القصير 485. يتم الكشف عن CFP أيضا بواسطة NDD.

اكتشاف مرشح تمرير النطاق 500 550 و Rod Domine Dextern بواسطة NDD. بعد مرشح تمرير النطاق 565 610 ، قبل عدة ساعات من التصوير ، اضبط غرفة التسخين على 32 درجة مئوية. ستحافظ درجة الحرارة هذه على درجة حرارة الجسم المثلى طوال التجربة.

لاحظ أن غرفة التسخين المستخدمة هنا مظلمة وتغطي الأهداف واللوحة الآلية للنظام. هذا يساعد على تجنب تلوث الضوء الخارجي. لتشغيل النظام أولا ، قم بتشغيل ليزر التيتانيوم الياقوت ، ثم قم بتشغيل باقي نظام المجهر.

قم بتشغيل برنامج الاستحواذ. هنا ، يتم استخدام برنامج Zeiss Zen. اضبط نطاق الطول الموجي لليزر على 870 نانومتر.

ثم حدد NDD المناسب للتسجيل. الفأر المستخدم في هذه التجربة هو فأر معدل وراثيا يسمى Mac blue ، والذي يعبر عن بروتين الفلورسنت السماوي تحت سيطرة محفز مستقبلات السائل الدماغي النخاعي. تعتمد طريقة التخدير الموصى بها على طول التصوير ، لذلك من الأفضل الرجوع إلى المستند المصاحب للحصول على التفاصيل.

أحد الجوانب الصعبة لهذا الإجراء هو حقن الوريد التائي ، لأنه من السهل تفويت الوريد. إذا حدث هذا ، فقم بإجراء الحقن خلف الحجاج بدلا من ذلك. بمجرد تخدير الفأر ، استخدم القراص للتحقق من فقدان الوعي عن طريق تحفيز وسادة القدم. مقبل.

لتلطيخ الأوعية الدموية ، قم بحقن 200 ميكرولتر من قضيب دومين ديكستران في وريد الذيل ، أو لتلوين العدلات. حقن 100 ميكرولتر من المحلول الملحي الذي يحتوي على LY ستة GPE. بعد الحقن ، ضع رأس الماوس بين ألواح الاحتفاظ بحامل تجسيمي مخصص يتكيف مع المجهر وجهاز استنشاق غاز التخدير.

هذا يضمن أن حركات التنفس لن تؤثر على التصوير. شد ألواح التثبيت لتمديد الجلد بين الأذنين والرأس. تحقق من الاستقرار.

بالضغط برفق على الرأس باستخدام القراص ، يجب ألا يتحرك الرأس. ثم تأكد من أن يتنفس بشكل طبيعي. لتحضير الماوس لتصوير الفوتونين ، استخدم إصبعا لتطبيق 70٪ من الإيثانول على شعر فروة الرأس ، مع الحرص على تجنب العينين.

ثم ضع ستارة مع فتحة لكشف فروة الرأس. بعد ذلك ، باستخدام مقص وقراصات معقمة ، قم بقص الجلد وإزالة فروة الرأس بالكامل من الجزء الخلفي من العظم الجداري إلى العظم الأمامي. حافظ على مسافة ثلاثة ملليمترات من العينين والأذنين لمنع النزيف الشديد.

قم بإزالة النسيج الضام السائب أو السمحاق الذي يغطي الجمجمة. ثم باستخدام منشفة ورقية دافئة مبللة ب PBS ، اغسل الشعر المتبقي كما هو موضح هنا. باستخدام إبرة قياس صغيرة ، ضع الغراء الجراحي على المحيط الكامل لحلقة مطاطية قطرها 10 ملم.

ثم ضع الحلقة المطاطية مباشرة على الجمجمة بمنشفة ورقية أخرى مبللة ب PBS. نظف الحلقة الداخلية للمرة الأخيرة. أضف PBS دافئا لغمر الجمجمة تماما.

ثم ضع الحامل التجسيمي تحت الهدف. بمجرد وضع الماوس في مكانه ، استخدم المجهر العيني مع الإرسال المباشر لعرض الجمجمة ووضعها تقريبا في مجال رؤية المجهر. في الجزء العلوي الأيسر من نافذة برنامج التصوير ، انقر فوق الاكتساب المباشر.

سيظهر مسح مباشر للأنسجة في منتصف النافذة باستخدام التحكم الاتجاهي المجهري في البرنامج. حدد موقع منطقة بها CFP وإشارة دومين قضيب لضبط التركيز. ثم اضبط طاقة الليزر على الحد الأدنى للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء مع الحد الأدنى من تلف الصورة.

بعد ذلك في البرنامج ، انقر فوق علامة تبويب القناة وقم بزيادة قوة الكسب على PMTs لكل NDD لتقليل تبييض الصور وتلف الصورة ، ثم انقر فوق علامة التبويب المناسبة لضبط إعدادات الاستحواذ على مسح فردي مع وقت سكون بكسل يبلغ 1.58 ميكروثانية ودقة 512 × 512 بكسل مع تكبير 1.5. بمجرد تعيين معلمات التسجيل ، انقر فوق أمر الاستحواذ المباشر وقم بمسح الأنسجة لاختيار حقل x و y و Z المطلوب لتتم مراقبته في الوقت الفعلي. هنا ، يتم اختيار حقل يشمل مناطق الأوعية الدموية والمتني.

بجوار حفظ أو تسجيل إحداثيات X و Y و Z للحقل الموضحة في علامة تبويب المواضع. انقر فوق إضافة. كرر هذه العملية مع ما يصل إلى ثلاثة حقول إضافية لتسجيل جميع إحداثيات الاهتمام.

ستظهر الإحداثيات في علامة تبويب المواضع بجوار توجيه البرنامج. لالتقاط مجموعة من الصور بثلاثة DZ ، انقر فوق نقل إلى في علامة تبويب المواضع في البرنامج للانتقال إلى الموضع المسجل الأول وحدد Zack في المربع العلوي الأيسر من البرنامج. سيؤدي هذا إلى فتح علامة تبويب مكدس Z ، والانتقال إلى أعلى موضع Z ، وضبط طاقة الليزر وفقا لذلك.

انقر فوق تعيين أخيرا ، ثم انتقل إلى أعمق موضع. اضبط طاقة الليزر. ثم انقر فوق تعيين أولا.

يجب تكييف سمك تحليل المكدس مع الخلية التي تمت دراستها بسرعة. سوف تخرج الخلايا المتحركة من الفرنسية بسرعة ، لذلك ستحتاج إلى الحصول على كومة أكثر سمكا. ثم تكتسب الخلايا بطيئة الحركة.

في المربع العلوي الأيسر، حدد أمر السلسلة الزمنية لفتح علامة تبويب السلاسل الزمنية. قم بتعيين عدد الدورات والفاصل الزمني. هنا ، سيتم الحصول على مجلد واحد كل 30 ثانية لمدة 60 دورة.

هذا يمثل 30 دقيقة في الوقت الفعلي. لبدء التصوير بفاصل زمني في النافذة الرئيسية ، حدد بدء التجربة طوال الإجراء ، واستمر في مراقبة للتأكد من أنه فاقد للوعي. تأكد أيضا من غمر الهدف بشكل صحيح.

بعد التقاط التسلسل، استخدم ماصة لإضافة PBS دافئ. ثم ابدأ عملية استحواذ ثانية مدتها 30 دقيقة. إذا شوهد الاختفاء التدريجي للإشارة أثناء الاستحواذ ، فتحقق من تسرب PBS.

بمجرد تسجيل جميع مقاطع الفيديو المطلوبة ، تم إجراء تحليل البيانات كما هو موضح في المستند المصاحب لدراسة فسيولوجيا نخاع العظام عن طريق التصوير الحيوي الداخلي ، تم حقن فأر ماك الأزرق المعدل وراثيا ب 2 مليون قضيب دالتون دومين ديكستران ، وتم تصويره بواسطة اثنين من الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر. كما هو موضح في هذا الفيديو ، في الصورة المجهرية الناتجة ، تظهر الأوعية الدموية الملطخة ب 2 مليون قضيب دالتون دومين ديكستران في العظم الأحمر ، كما هو موضح باللون الأزرق من خلال الجيل التوافقي الثاني. توجد الخلايا الوحيدة الإيجابية ECFP الموضحة في السماوي داخل منافذ متني ، والتي ينظر إليها على أنها مناطق مظلمة بين الأوعية الدموية والعظام ، وداخل الأوعية.

لحساب مسار الخلية الفردية ، تم إجراء تصوير بفاصل زمني. يوضح هذا الفيديو السلوك المهاجر للخلايا الوحيدة المتني. إشارة ECFP باللون السماوي وتظهر مسارات الهجرة لكل بقعة حمراء باللون الأخضر.

هنا ، يمكن رؤية السلوك المهاجر للخلايا الوحيدة الوعائية. يمكن استخدام هذه البيانات لحساب كل من متوسط السرعة ومتوسط الإزاحة المربعة للخلايا. لاحظ أن الخلايا الوحيدة الوعائية تظهر زيادة في الإزاحة وزيادة السرعة مقارنة بالخلايا الوحيدة المتني.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تتبع الخلايا الوحيدة لنخاع عظم الفأر في الجسم الحي باستخدام تصويرين للصور بعد تطويره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف هجرة الخلايا وتفاعلها في نخاع العظام ، والتي تمثل موقعا مهما جدا لتكون الدم ، ولكن أيضا وظائف أساسية أخرى مثل تحضير المستضد والذاكرة المناعية.