تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص كيفية تأثير الخلايا المقيمة في الأنسجة على قدرة الخلايا البطانية الوعائية على دعم استقطاب الكريات البيضاء أثناء الالتهاب. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء مستنبتات مشتركة للخلايا البطانية مع الخلايا الجذعية الميزنشيمية أولاً، وذلك باستخدام أحد نموذجين وعائيين في المختبر، وهما نموذج الشريحة الدقيقة ونموذج المرشح. ثم تُعالج هذه المستنبتات بالسيتوكينات قبل إجراء مقايسة التدفق.

يتم بعد ذلك تجميع نظام aian القائم على التدفق بطريقة تدريجية، مع إجراء تعديلات بناءً على نموذج النظام المستخدم. وتتمثل الخطوة النهائية في تروية الخلايا البيضاء فوق الخلايا البطانية ومراقبة تجنيدها من التدفق، بالإضافة إلى مراقبة سلوكها اللاحق. وفي النهاية، أظهرت اختبارات الالتصاق هذه القائمة على التدفق والمتعددة الخلايا أن التآثر المتبادل بين الخلايا الجذعية الميزنشيمية والخلايا البطانية يثبط تجنيد الخلايا المتعادلة أثناء الالتهاب.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال انتقال الكريات البيضاء، مثل كيف تقوم الخلايا المقيمة في الأنسجة، على سبيل المثال، الخلايا الجذعية الميزنكيمية، بتعديل هذه العملية؟ وهل يتغير هذا في أمراض مثل الالتهاب المزمن أو السرطان؟ وهل يمكننا استخدام هذه المعرفة للمساعدة في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة؟ للبدء، قم بإنشاء مستنبتات مشتركة من الخلايا البطانية مع الخلايا الجذعية الميزنكيمية باستخدام نموذج الشريحة الدقيقة أو نموذج المرشح كما هو موضح في البروتوكول النصي لتجميع نظام التدفق.

قم أولاً بتشغيل السخان وضبطه على 37 درجة Celsius. ثم قم بتوصيل محقنة سعة 20 milliliter بعد إزالة المكبس منها، بالإضافة إلى محقنة سعة five milliliter بصنبور ثلاثي الاتجاهات. بعد ذلك، قم بقياس وقص قطعة طويلة من أنبوب بقطر 2.4 millimeter تكون مساوية تقريباً للمسافة بين الصمام والصنبور ثلاثي الاتجاهات.

اقطع قطعة من الأنبوب بقطر 1.3 millimeter وطول يتراوح بين 8 إلى 10 millimeter، ثم أدخلها في أحد طرفي الأنبوب السميك. قم بتوصيل طرف الأنبوب السميك بصنبور ثلاثي الاتجاهات، ثم صل الطرف الآخر للأنبوب الرفيع بفتحة في الصمام الإلكتروني الدقيق ثلاثي الاتجاهات لتشكيل خزان الغسيل.

ثم قم بتثبيت الصنبور في غرفة البيرسبيكس باستخدام شريط ميكروبور. بعد ذلك، قم بتركيب قطعة من الأنابيب السميكة والرقيقة بطول ستة إلى ثمانية مليمترات، وأدخل الأنبوب الرقيق في أحد طرفي الأنبوب السميك. قم بتوصيل طرف الأنبوب السميك بمحقنة سعة 2 mL بعد إزالة المكبس منها.

قم الآن بتوصيل الطرف ذي الأنبوب الرفيع للمحقنة سعة 2 مل بفتحة في الصمام الإلكتروني الدقيق لإنشاء خزان العينة. بعد ذلك، قم بقياس وقص قطعة طويلة من الأنبوب الرفيع تعادل المسافة بين الصمام الدقيق ومركز منصة المجهر. بالنسبة لموديل الشريحة المجهرية، قم بتوصيل قطعة من الأنبوب السميك بطول 8 إلى 10 ملم بنهاية الأنبوب الرفيع.

ثم ضع موصلاً على شكل حرف L في نهاية الأنبوب السميك؛ حيث سيتصل هذا الموصل بالشريحة المجهرية أو بنموذج المرشح. قم بتثبيت قطعة بطول 8 إلى 10 مليمتر من أنابيب توصيل المانومتر من نوع portex blue line في نهاية الأنبوب الرفيع.

بعد ذلك، ضع طرف الأنبوب الرفيع على الصمام الدقيق. وبذلك يصبح الأنبوب هو المخرج المشترك لخزانات الغسيل والعينات. املأ الخزانات بمحلول ملحي منظم بالفوسفات يحتوي على ألبومين المصل البقري.

قم بتحضير الأنابيب عن طريق تمرير PBSA لإزالة أي فقاعات هوائية، ثم قم بتوصيل أنبوب المانومتر بمحقنة زجاجية سعة 50 milliliter. في حالة نموذج الشريحة الدقيقة، قم فقط بتوصيل قطعة من الأنبوب السميك بطول 10 إلى 12 millimeter بنهاية أنبوب المانومتر المؤدي إلى المحقنة الزجاجية. ضع وصلة على شكل حرف L في نهاية الأنبوب السميك.

قم بتهيئة المحقنة عن طريق ملئها بـ 10 milliliters من PBSA. اقلب المحقنة بحيث يكون الطرف المتصل بالأنبوب موجهاً للأعلى، ثم ادفع جميع الفقاعات الهوائية إلى الخارج قبل إعادة ملئها بخمسة milliliters من PBSA. وأخيراً، ضع المحقنة الزجاجية في مضخة محاقن لعملية الحقن والسحب.

قم بضبط معدل إعادة التعبئة وقطر السرنجة الزجاجية لتجهيز الشرائح الدقيقة للتدفق. ضع الشريحة الدقيقة على منصة مجهر تباين الأطوار المقلوب. أدر الصنبور ثلاثي الاتجاهات للسماح لـ PBSA بالتدفق عبر أنابيب الإدخال.

قم بتوصيل الموصل الذي على شكل حرف L بفتحة الدخول في قناة الشريحة الدقيقة. بعد ذلك، ضع الموصل الذي على شكل حرف L من مضخة المحقنة في فتحة الخروج للقناة. نظف أي PBSA قد تسرب على الشريحة الدقيقة.

بدلاً من ذلك، وبالنسبة لنموذج المرشح، يتم أولاً قص قطعة من فيلم البارافين (para film) لتكون بنفس حجم غطاء الشريحة الزجاجية باستخدام قالب معدني. ثم يتم قص فتحة بمقاس 20 في 4 مليمتر في فيلم البارافين باستخدام قالب معدني لإنشاء قناة التدفق. استخدم حاشية فيلم البارافين لتحديد قناة التدفق على غطاء الشريحة الزجاجية.

قم بمحاذاة حواف المرشح السداسي الآبار مع غطاء الشريحة الزجاجية. تأكد من أن المرشح يغطي علامات قناة التدفق. قم بقص المرشح بعناية باستخدام مشرط من النوع 10.

بعد ذلك، قم بتغطية المرشح بعناية بحشية من البارافورم، مع التأكد من أن فتحة قناة التدفق تقع في منتصف المرشح. استخدم قطعة من المناديل الورقية النظيفة واضغط لإخراج أي فقاعات. الآن، ضع غطاء الشريحة في التجويف الموجود في الصفيحة السفلية لغرفة التدفق المصنوعة من البيرسبكس.

ضع لوح البيرسبيكس العلوي فوق الحشية ثم اربط اللوحين معاً. أدر الصمام ثلاثي الاتجاهات للسماح لمحلول غسيل PBSA بالتدفق عبر الصمام. بعد ذلك، قم بتوصيل أنبوب المانومتر بفتحة الإدخال في لوح البيرسبيكس العلوي.

قم بتمرير PBSA عبر قناة التدفق للسماح بمرور الفقاعات. بعد ذلك، قم بتوصيل أنابيب المانومتر من مضخة الحقنة بفتحة المخرج في لوحة البيرسبيكس. قم بتنظيف أي كمية من PBSA تسربت على اللوحة العلوية للغرفة.

أخيراً، ضع الغرفة على منصة مجهر تباين الأطوار المقلوب واضبط التركيز لرؤية الخلايا البطانية فوق المرشحات من أجل تروية الكريات البيضاء فوق الخلايا البطانية. اضبط مضخة الحقنة على إعادة التعبئة واضغط على تشغيل بمجرد ضبط التركيز. ولرؤية الطبقة أحادية الخلايا من الخلايا البطانية، ضع 2 mL من الخلايا المتعادلة المنقاة في خزان العينة واتركها لتدفأ لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، اغسل البطانة باستخدام PBSA لمدة دقيقتين. افتح الصمام لتروية الخلايا المتعادلة فوق البطانة. قم بتوصيل دفعة الخلايا المتعادلة لمدة أربع دقائق.

أغلق الصمام وقم بتروية PBSA من خزان الغسيل لما تبقى من التجربة. عند إجراء التجربة، تأكد من عدم مرور فقاعات الهواء في أي نقطة أثناء المقايسة، لأن ذلك سيؤدي إلى تعطيل الطبقة الأحادية للخلايا البطانية ويتسبب في انفصال الخلايا المتعادلة الملتصقة. قم بتسجيل تجنيد الخلايا المتعادلة إما أثناء تدفق الخلايا المتعادلة أو بعد التروية باستخدام برنامج التقاط الصور الرقمية.

حدد مركز القناة عن طريق تحريك الشيئية إلى حافة القناة عند منفذ الإدخال وتحديد منتصف المنفذ. قم بإجراء جميع التسجيلات الرقمية لما لا يقل عن 5 إلى 10 حقول في مركز قناة التدفق أو التسجيل أثناء تدفق الخلايا المتعادلة. التقط صوراً لحقل واحد كل 10 ثوانٍ لمدة دقيقة واحدة، ثم تحرك على طول القناة وسجل حقلاً آخر لمدة دقيقة واحدة.

كرر هذه العملية طوال فترة حقن الجرعة (bolus) لتسجيل ما بعد التروية. قم بإجراء تسجيل لمدة عشر ثوانٍ لخمسة إلى 10 حقول على طول مركز قناة التدفق لتقييم سلوك الكريات البيضاء. التقط صوراً كل ثانية واحدة خلال هذه الفترة الزمنية البالغة عشر ثوانٍ.

يتيح ذلك وقتًا كافيًا لتحليل عملية الالتقاط من التدفق وسلوك الخلايا المتعادلة الملتصقة. قم بتسجيل حقل واحد يحتوي على 10 خلايا متعادلة مهاجرة عبر الغشاء على الأقل لمدة خمس دقائق، مع التقاط الصور كل 30 ثانية. يمكن استخدام ذلك لحساب سرعة الخلايا المهاجرة، لذا قم بتسجيل سلسلة أخرى من الحقول لمدة عشر ثوانٍ.

يتيح ذلك للخلايا المتعادلة الوقت الكافي للهجرة عبر الطبقة أحادية الخلايا المبطنة. وأخيراً، أوقف مضخة الحقنة وأزل أنبوب المخرج، ثم أنبوب المدخل، وقم بتفكيك غرفة التدفق وشطف خزان العينات باستخدام PBSA، وكرر العملية للمرشحات وقنوات الشرائح المجهرية اللاحقة قبل الانتقال إلى تحليل تجنيد كريات الدم البيضاء وسلوكها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. وفي نموذج الشريحة المجهرية، أدى التحفيز بالسيتوكين باستخدام عامل نخر الورم ألفا إلى زيادة ملحوظة في التصاق الخلايا المتعادلة بالبطانة بطريقة تعتمد على الجرعة.

بالإضافة إلى ذلك، لوحظ انخفاض يعتمد على الجرعة في نسبة الخلايا المتعادلة التي تتدحرج على السطح البطاني عند استخدام TNF alpha. وانعكس ذلك في زيادة تعتمد على الجرعة في نسبة الخلايا المتعادلة المهاجرة عبر الطبقة الأحادية البطانية، وبالتالي التي تخضع للهجرة عبر الخلايا البطانية. كما لوحظت نتائج مماثلة باستخدام مقايسة التدفق القائمة على المرشح.

على سبيل المثال، أدى تحفيز TNF alpha إلى زيادة التصاق الخلايا المتعادلة بطريقة تعتمد على الجرعة. وقد أدى الاستزراع المشترك للخلايا البطانية مع الخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من نخاع العظم إلى تقليل التصاق الخلايا المتعادلة بشكل ملحوظ مقارنة بالخلايا البطانية. استزرعت الخلايا بمفردها كما هو متوقع لنموذج الشريحة المجهرية.

ومرة أخرى، لُوحظت تأثيرات مماثلة عند استخدام النموذج القائم على المرشح، حيث ظهر التصاق أقل في المزرعة المشتركة مقارنة بالمزرعة الأحادية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص كيفية تواصل الخلايا السدوية مع الخلايا البطانية للتأثير على استقطاب الكريات البيضاء أثناء الالتهاب.