البروتين تنقية تقنية تسمح الكشف عن Sumoylation وUbiquitination من الناشيء الخميرة الحيز الحركي البروتينات Ndc10 وNdc80

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن محاكاة وانتشار البروتينات الأساسية الحركية للخميرة الناشئة ، NDC 10 و NDC 80. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد خلايا الخميرة الأولى التي تعبر عن علم الهسهسة الموسومة SMT three و MT الموسومة NDC 10 أو NDC 80 ، وصنع مستخلصات البروتين من هذه الخلايا. الخطوة الثانية هي تنقية علم الهسهسة الموسومة SMT ثلاثة مترافقات للكشف عن الجمع أو لترسيب مناعي mik tagg البروتينات الأساسية الحركية للكشف عن كل مكان.

بعد ذلك ، يتم الكشف عن المجموع أو الانتشار في كل مكان عن طريق تحليل اللطخة الغربية. في النهاية ، يؤكد وجود نمط سلم ل NDC 10 و NDC 80 أن هذه البروتينات محاكاة وموجودة في كل مكان. تسمح طريقة تنقية البروتين الموصوفة بالكشف عن كل من المحاكاة والتشفير في كل مكان لبروتينات connico ND C 10 و NDC 80 في الخميرة العسرية الناشئة.

بلدي cci. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن السلالة التي أنشأناها لها هجومان للحاتمة ، أحدهما على بروتين الاختبار ، والآخر يسمح باكتشاف المحاكاة. يقلل استخدام هذه العلامات من الخلفية بسبب التفاعل المتقاطع الذي يتم ملاحظته بشكل متكرر عند استخدام مصل متعدد النسيلة.

سيتم عرض هذا الإجراء من قبل جامعة كانيرو ، زميل باحث في مختبري. سيتم استخراج البروتينات ذات الأهمية من كريات خلايا الخميرة المحضرة مسبقا وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. Resus ، قم بتعليق الخلايا في 0.5 مل من العازلة الباردة المثلجة.

استخدم عازلة غينيا إذا كان المستخلص مخصصا لفحص منسدل باستخدام نتريل النيكل أو حمض الخليك الثلاثي أو حبات النيكل NTA فائقة التدفق. استخدم المخزن المؤقت A إذا كان المستخلص مخصصا للترسيب المناعي. احتفظ بالأنابيب على الجليد في جميع الأوقات.

نقل معلقات الخلية إلى ملليلتر. غطاء المسمار ثنائي لكل أنبوب. أضف حجما من الخرز الزجاجي يساوي حجم حبة تعليق الخلية.

تغلب على الخلايا في مضرب حبة صغيرة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ثم ضع الأنابيب على الجليد لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. كرر الخرز والثلج ثلاث مرات. دوامة على سرعة عالية عند أربع درجات مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

افحص الخلايا عن طريق التصور تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد تحلل. ستظهر الخلايا المحللة كأشباح داكنة وتفتقر إلى حدود أو شكل محدد. على النحو الأمثل ، يجب أن يتم الكذب على الأقل 80٪ من الخلايا.

بعد ذلك ، استخدم دبوس دفع لثقب ثقب في قاع الأنبوب. ضع الغطاء اللولبي بشكل غير محكم وضع الأنبوب في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 1000 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

لجمع المحللة ، انقل المحللة إلى جهاز طرد مركزي أنبوب طرد مركزي دقيق عند 15،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لجمع البروتينات المستخرجة. بعد قياس تركيز البروتينات المستخرجة باستخدام مجموعة فحص البروتين ، قم بتطبيع جميع المستخلصات بحيث تحتوي كل منها على نفس الكمية من البروتين. ارفع الحجم الإجمالي إلى مليلتر واحد باستخدام المخزن المؤقت المناسب.

يتم الحصول على ما يقرب من خمسة ملليغرام من البروتين الكلي من 50 OD 600 من الخلايا. وفر 50 ميكرولتر من البروتين المستخرج كمستخلص الخلية الكاملة. سيتم استخدام 950 ميكرولترا المتبقية من مستخلص البروتين لاحقا لتنقية البروتين أو الترسيب المناعي للبروتينات الموسومة MT.

أضف 50 ميكرولترا من عينة laly إلى 50 ميكرولترا من مستخلص الخلية الكاملة. احتضان العينات عند 100 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق قبل تحليلها بواسطة اللطخة الغربية. ابدأ هذا الإجراء عن طريق تحضير حبات النيكل NTA فائقة التدفق اللازمة للتنقية.

احصل على كمية الخرز التي يحتاجها الطرد المركزي منخفض السرعة لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة المادة الطافية وغسل الخرزات باستخدام PBS. أضف ملليلتر واحد من PBS واقلب الأنبوب من الأعلى إلى الأسفل حتى يتم تعليق الخرز.

اجمع الخرز عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة وقم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخرزات بهذه الطريقة ما مجموعه خمس مرات. قم بتعليق الخرزات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغين وقم بتقسيمها إلى عدد الأنابيب المقابلة للعينات المراد معالجتها.

اجمع الخرزات عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة وقم بإزالة المادة الطافية لكل عينة. أضف 950 ميكرولتر من مستخلص الخلية بالكامل. أعدت في وقت سابق إلى 100 ميكرولتر من الخرز.

احتضان على منصة هزازة عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل أو بين عشية وضحاها. جهاز طرد مركزي عند 800 إلى 1500 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. وفر 50 ميكرولتر من المادة الطافية.

أضف 50 ميكرولترا من عينتين × عينة laly إلى هذا المادة الطافية واحتضانها عند 100 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. سيتم تحليل 10 ميكرولتر من كل عينة لاحقا بواسطة اللطخة الغربية. اغسل حبات النيكل NTA فائقة التدفق مرة واحدة بمليلتر واحد من عازلة غينيا لمدة خمس إلى 10 دقائق على منصة هزازة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، اغسل الخرزات خمس مرات باستخدام ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للكسر بعد الغسيل النهائي باستخدام كسر المخزن المؤقت لإعادة تعليق الخرزات في 90 ميكرولتر من عينتين × عينة laly. أضف 10 ميكرولترات من وحدة مولية واحدة للمساعدة في فصل البروتين الموسوم به عن النيكل NT. تحتضن الخرزات عند 100 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. ثم تقوم الدوامة بأجهزة الطرد المركزي عند 13 ، 000 مرة G لمدة 30 ثانية.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. لبدء هذا الإجراء ، احصل على الكمية اللازمة من الأجسام المضادة للهلام المضادة للتقارب الهوائي عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة. قم بإزالة المادة الطافية ، واغسل الراتنج بمحلول علني A أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت A واقلب الجزء العلوي فوق الأسفل حتى يتم تعليق الراتنج.

اجمع الراتنج عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة وقم بإزالة المادة الطافية. اغسل ما مجموعه خمس مرات. قم بتعليق الراتنج في مليلتر واحد من المخزن المؤقت A وقم بتحويله إلى عدد الأنابيب المقابلة للعينات المراد معالجتها.

اجمع الراتنج عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة وقم بإزالة المادة الطافية. أضف 950 ميكرولترا من مستخلص الخلية الكاملة إلى 25 ميكرولترا من الراتنج احتضن على منصة هزاز عند أربع درجات مئوية طوال الليل في اليوم التالي. جهاز طرد مركزي عند 800 إلى 1500 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية.

وفر 50 ميكرولتر من المادة الطافية. أضف 50 ميكرولترا من عينتين عازلتين إلى هذا المادة الطافية واحتضانها عند 100 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. اغسل الراتنج بالعازلة أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت ، مقلوب من الأعلى فوق الأسفل حتى يتم تعليق الراتنج.

اجمع الراتنج عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة وقم بإزالة المادة الطافية بعد إزالة المادة الطافية من الغسيل النهائي. أعد تعليق الراتنج في 100 ميكرولتر من احتضان عينة السوم عند 100 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. ثم تقوم الدوامة بأجهزة الطرد المركزي عند 13 ، 000 مرة G لمدة 30 ثانية.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. أخيرا ، قم بتحميل جميع العينات التي تم جمعها من هذا البروتوكول. في صفحة SDS ، تم استخدام جل لتحليل اللطخة الغربية ، سلالات الخميرة التي تعبر عن علم بولي هيستامين الموسومة SMT three أو HF SMT three و MT الموسومة NDC 80 و NDC 10 للكشف عن محاكاة بروتينات الحركية.

تم تنقية ثلاث ركائز HF SMT باستخدام حبات النيكل واكتشافها بجسم مضاد مضاد للعلم. تم اكتشاف NDC 80 المجموع في ثلاث ركائز HF SMT عند فحصها بجسم مضاد مضاد للميكروفون. يشير عدم وجود بروتينات معدلة في سلالات التحكم بدون HF SMT three إلى خصوصية التفاعل بين HF SMT three والبروتينات المستهدفة.

علاوة على ذلك ، يتم تقليل جمع NDC 80 و NDC 10 في الخلايا المعالجة بنعل NOCO للكشف عن انتشار NDC 80 و NDC 10. كان Mick الموسوم ب ND C 80 أو ND C 10 مترسبا مناعيا وتم إجراء تحليل اللطخة الغربية باستخدام تحليل الأجسام المضادة للميكروفون ومضاد لليوبيكويتين لمستخلص الخلية الكاملة وأكد الطاف التعبير عن NDC 80 M و NDC 10 M العينات المناعية المترسبة التي تم فحصها باستخدام مضاد MIC نطاقات متعددة للوزن الجزيئي العالي مما يشير إلى أن NDC 80 و NDC 10 يحتويان على تعديلات ما بعد الترجمة. أظهر نمط السلم للعينات المترسبة المناعية التي تم فحصها باستخدام مضادات اليوبيكويتين أن ND C 80 و ND C 10 موجودان في كل مكان.

تم تعزيز أنماط السلم ل NDC 80 و NDC 10 عن طريق العلاج بمثبط البروتيازوم MG 1 32. مزيد من التأكيد على أن هذه تمثل poly ubiquitination بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لتقنية تنقية البروتين التي تسمح بالكشف عن التطعيم والتطعيم من الخفافيش NN.