إنشاء الإنسان الظهارية Enteroids وColonoids من الأنسجة كامل وخزعة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد مدخلات بشرية من أنسجة الأمعاء. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الغشاء المخاطي للأمعاء أولا من الأنسجة تحت المخاطية الأساسية. الخطوة الثانية هي احتضان الغشاء المخاطي باستخدام EDTA لتعزيز تفكك الظهارة عن النسيج الضام.

بعد ذلك ، يتم فصل الخبايا المعوية عن الظهارة المنفصلة. أخيرا ، يتم زراعة الخبايا المعوية في مصفوفة الغشاء القاعدي. في النهاية ، يتم استخدام تقنيات الكيمياء الهيستولوجية المناعية لإظهار التنظيم الظهاري بالإضافة إلى العلامات الظهارية المحددة ل OIDs المستنبتة.

الآثار المترتبة على هذه الطريقة هي حقيقة أنه يمكننا الآن إنشاء OIDs من الخزعات الخاصة بالمريض ، مما يعني أنه يمكننا الآن استخدام هذا النسيج في المختبر للنظر في الأمراض المعوية والتشخيصات ، وهو ما لم نتمكن من القيام به من قبل الآن. بعد تحضير المخازن المؤقتة والكواشف ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بإذابة الغشاء القاعدي على الجليد واحتضان صفيحة 24 جيدا مسبقا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية عند استلام الأنسجة. استخدم PBS من KO بدون الكالسيوم والمغنيسيوم أو DPBS لغسل الأنسجة حتى يصبح DPBS صافيا.

ضع المنديل في طبق بتري زجاجي مطلي بالسيليكون مملوء ب DPBS المثلج مع توجيه الجانب المخاطي لأعلى وباستخدام دبابيس minuchin قم بتأمين الأنسجة عن طريق تمديده وتثبيته. بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح ، استخدم مقصا صغيرا ملقطا منحنيا دقيقا لإزالة الغشاء المخاطي الأساسي من تحت الغشاء المخاطي والنسيج الضام. ثم مع توجيه الجانب المخاطي لأعلى ، قم بتمديد الغشاء المخاطي المقطوع وتثبيته بشكل مسطح على طبق بتري الزجاجي المطلي بالسيليكون.

باستخدام ملقط منحني ، اكشط سطح الغشاء المخاطي برفق. هذه الخطوة ضرورية لتحسين جودة التحضير. قم بتغطية الغشاء المخاطي بمخزن خلبي EDTA محضر حديثا.

ثم بعد غسل الأنسجة على الجليد ، ثلاث إلى أربع مرات وفقا لبروتوكول النص تحت مجهر تشريح ، استخدم ملقطا منحنيا لكشط الغشاء المخاطي برفق لإطلاق الخبايا المعوية باستخدام ماصة. قم بإزالة تعليق القبو برفق من طبق بتري وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ثم افحص الأنسجة للتأكد من إزالة جميع الخبايا تقريبا من الغشاء المخاطي.

قم بتصفية تعليق القبو من خلال مرشح 150 ميكرومتر مرتين واستخدم مجهرا للتحقق من التدفق من خلال غسل تعليق القبو ونقل عدد الخبايا اللازمة إلى أنبوب سفلي دائري بسعة خمسة ملليلتر ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بالطرد المركزي لجزء القبو لمدة 10 دقائق عند 150 جيجابايت وأربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة المادة الطافية باستخدام أطراف الماصة المبردة مسبقا ومصفوفة الغشاء القاعدي Resuspend. بيليه القبو.

ضع 50 ميكرولترا من تعليق القبو في مصفوفة غشاء القاعدة لكل بئر على لوحة التدفئة عن طريق إخراج مصفوفة الغشاء القاعدي ببطء في وسط البئر. احتضان اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية 5٪ لمدة 30 دقيقة للسماح بالبلمرة الكاملة لمصفوفة الغشاء القاعدي. ثم قم بتراكب مصفوفة الغشاء القاعدي ب 500 ميكرولتر من وسط الأمعاء البشرية المصغرة الكاملة ، مع استكمال 2.5 ميكرومولار لكل من CHIR 9 0 2 2 1.

ويحتضن النسيج ويغير الوسط بعد يومين ، ثم كل يومين بعد ذلك. يوضح هذا الشكل مثالا نموذجيا للخبايا المعزولة حديثا من الأنسجة الكاملة. عدد الخبايا المعزولة من الخزعة أقل مما هو عليه في الأنسجة الكاملة.

عادة ما يتم إجراء لدغتين من الخزعة بتمريرة واحدة. ينتج عن كل لدغة خزعة سطح 10 ملم مربع بمتوسط 50 إلى 100 لقطة لكل خزعة. بعد الثقافة ومصفوفة الغشاء القاعدي لمدة خمسة إلى ستة أيام ، يتم تقريب Crips لتشكيل كرات معوية للأمعاء الدقيقة وكرات القولون للقولون ويتم تمريرها بعد سبعة أيام.

الإدخالات أو OIDs التي تم إنشاؤها من الخزعات الموضحة هنا لنفس التطور بكثافة أقل عند البذر. لذلك ، يتم التغليف عادة بعد 10 إلى 12 يوما في الثقافة. كما هو موضح هنا ، يقدم كل من OIDs و OIDs جانبا لموعيا ومبطنا بظهارة.

يمكن ملاحظة الخلايا التكاثرية داخل OIDs وتقع داخل أطراف البراعم. يظهر التصوير متحد البؤر ل OIDs الملطخة بالكاترين الإلكتروني هنا باللون الأخضر الخلايا الظهارية. يوضح هذا الشكل يدخل النمو من مريض مصاب بالتليف الكيسي واعتلال معوي خصلة بسبب طفرة خلقية في جين جزيء التصاق الخلية الظهارية.

يمكن استخدام هذا الإجراء أو طريقة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي أو الدم الغربي للإجابة على سؤال إضافي يتعلق بجين أو مسألة أهمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل Crips البشري باستمرار لتتمكن من إنشاء مدخلات بكفاءة في مختبرك للإجابة على الأسئلة الخاصة بمريضك.