جيل من الخلايا الجذعية الدهنية لجسم الإنسان من خلال فقد التمايز من الناضجة الخلايا الشحمية في الثقافات السقف
مارس 7, 2015
قد تمثل الخلايا الشحمية الناضجة مصدرا وفيرا للخلايا الجذعية من خلال عدم التمايز ، مما يؤدي إلى مجموعة متجانسة من الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية. يستخدم هضم الكولاجيناز لعزل الخلايا الشحمية الناضجة عن الدهون البشرية. الهدف من بروتوكولنا هو الحصول على خلايا دهنية متعددة القدرات وغير متمايزة من الخلايا الشحمية البشرية الناضجة.
تمتلك الخلايا الدهنية الناضجة القدرة على التمايز إلى خلايا سلفية في المختبر. ويتم تحقيق ذلك من خلال الزراعة المختومة، وهي تقنية يتم فيها استزراع الخلايا الناضجة في قارورة مملوءة تماماً بالوسط الغذائي وتُستزرع في وضع مقلوب. تلتصق الخلايا العائمة بجدار القارورة وتتغير مورفولوجيتها، حيث تتحول من خلية مستديرة مليئة بالدهون إلى خلية مستطيلة تشبه الخلايا الليفية. متجانسة.
يمكن الحصول على مجموعات من الخلايا المستطيلة وتنقيتها فور استلام عينات الأنسجة في المختبر. قم بوزن الأنسجة الدهنية، وبناءً على عدد الخلايا الدهنية المطلوبة، ضع حجماً مناسباً من العينة في أنبوب سعة 50 ml للهضم؛ ومن المتوقع الحصول على حوالي 1 مليون خلية لكل جرام من النسيج.
تُجرى المزارع السقفية باستخدام 500,000 خلية لكل قارورة سعة 25 centimeter، و 50,000 خلية لكل بئر في طبق سداسي الآبار. أضف محلول KRH المخفف والمكمل بإنزيم collagenase، ثم قم بتقطيع النسيج باستخدام المقص وحضّن المستحضر عند درجة حرارة 37 °C لمدة 45 دقيقة. وأثناء فترة التحضين، قم بتجهيز مجموعة الأنابيب والمحقنة. صُب المحلول الشفاف عبر شبكة نايلون في كؤوس بلاستيكية باستخدام ملاقط.
قم بفرك تحضير الخلايا عبر الشبكة واغسلها برفق باستخدام 5 ml من محلول KRH المنظم العامل. انقل معلق الخلايا المُرشح إلى أنبوب سعة 50 ml باستخدام أنبوب ومحقنة. اترك الخلايا الدهنية الناضجة لتركد لمدة 10 دقائق تقريباً.
سترتفع الخلايا إلى سطح المحلول المنظم عن طريق الطفو. اسحب المحلول المنظم ببطء من القاع. وباستخدام حقنة وأنبوب، أضف 20 mls من محلول KRH المنظم الجاهز للعمل للغسل.
كرر خطوات الغسيل مرتين. اجمع المحلول المنظم للوصول بمعلق الخلايا الدهنية إلى حجم نهائي قدره 5 mls، ثم ابدأ في عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). املأ قارورة T 25 إلى ثلاثة أرباع حجمها بوسط D-M-E-M-F 12 المكمل بـ 20% calf Serum، ثم انقل 500,000 من الخلايا الدهنية الناضجة إلى القارورة. أكمل ملء القارورة بالوسط الغذائي وقم بإزالة الفقاعات الهوائية من السطح العلوي.
أحكم إغلاق القارورة باستخدام سدادة مُصنعة. تُحضن القارورة مقلوبة لمدة أسبوع واحد في حاضنة زراعة خلايا تحتوي على 5% carbon dioxide. يجب تجنب تحريك القارورة لأن الفقاعات المتبقية قد تؤدي إلى تعطيل التصاق الخلايا.
ضع غطاءً زجاجياً في قاع الآبار. أضف الجلبة البلاستيكية إلى البئر، ثم املأ البئر بـ eight mls من الوسط الزرعي. تأكد من عدم وجود فقاعات.
ضع غطاء شريحة على الجلبة، مع ترك مساحة لإدخال طرف الماصة. قم بأخذ عينة مكونة من 50,000 خلية وحقنها بوضع الطرف بين غطاء الشريحة والجلبة. قم بتحضين الطبق في حاضنة زراعة الخلايا مع 5% carbon dioxide لمدة أسبوع أو أقل.
بناءً على تصميم التجربة، يلزم توفر ثلاثة أيام على الأقل لالتصاق الخلايا بغطاء الشريحة في طبق مختلف. تُقلب أغطية الشرائح في 2 mL من الوسط الغذائي. وفي استزراع مستمر، يمكن بعد ذلك تثبيت أغطية الشرائح في الفورمالين من أجل تجارب التألق المناعي أو من أجل استخلاصات D-N-A-R-N-A والبروتين.
تؤدي عملية إزالة تمايز الخلايا الدهنية الناضجة إلى تغييرات رئيسية في مورفولوجيا الخلايا. وخلال هذه العملية، تفقد الخلايا الدهنية نمطها الظاهري وينخفض تعبير النسخ المرتبطة عادةً بوظيفة تخزين الدهون لديها. تمثل صورة التألق المناعي هذه خلايا دهنية في حالات مختلفة من إزالة التمايز.
لا تزال الخلايا ذات المورفولوجيا المستديرة تعبّر عن FABP four، وهو مؤشر للخلايا الدهنية الناضجة، بينما لم تعد الخلايا المستطيلة تعبّر عنه بناءً على الدراسات السابقة. يمكن الحصول على الخلايا الدهنية المتمايزة، والتي تسمى غالباً D fat cells، من مرضى نحفاء أو مرضى يعانون من السمنة المفرطة (OB)، سواء كانوا من الشباب أو كبار السن. وتتميز هذه الخلايا بقدرتها على الزرع طويل الأمد وتعدد قدراتها الوظيفية المثبتة.
كما أنني أقدر إمكاناتها في هندسة الأنسجة والعلاج الخلوي أيضاً. فقد تمثل نموذجاً جديداً للبحث المتخصص في فسيولوجيا الخلايا الدهنية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستكشف هذه الدراسة عملية فقدان التمايز للخلايا الدهنية الناضجة وتحويلها إلى خلايا جذعية متعددة القدرات. ومن خلال استخدام تقنيات الهضم بالـ collagenase والزراعة المختومة، يمكن للباحثين عزل هذه الخلايا واستزراعها للحصول على مجموعة متجانسة من الخلايا الشبيهة بالأرومات الليفية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- أبحاث الخلايا الجذعية
- بيولوجيا الخلايا الدهنية
- تقنيات زراعة الخلايا
خلفية علمية
- يمكن للخلايا الدهنية الناضجة أن تتمايز عكسياً إلى خلايا سلفية.
- يمكن تنفيذ هذه العملية في المختبر باستخدام طرق زراعة محددة.
- يعد عزل الخلايا الدهنية أمراً بالغ الأهمية للحصول على الخلايا الجذعية.
- يعتبر الهضم بواسطة الكولاجيناز طريقة قياسية لعزل الخلايا.
الغرض من الدراسة
- الحصول على خلايا دهنية متعددة القدرات وغير متمايزة من الخلايا الدهنية البشرية الناضجة.
- وضع بروتوكول لعزل هذه الخلايا واستزراعها.
- استقصاء التغيرات المورفولوجية التي تحدث أثناء عملية إزالة التمايز.
الطرق المستخدمة
- الهضم بواسطة إنزيم الكولاجيناز لعزل الخلايا الدهنية الناضجة.
- تقنية المزارع المختومة لتعزيز عملية إزالة التمايز.
- تقييم مورفولوجيا الخلايا للتأكيد على حدوث إزالة التمايز.
- تقدير كمية الخلايا الناتجة بناءً على وزن النسيج.
النتائج الرئيسية
- عزل ناجح لحوالي 1 مليون خلية لكل جرام من النسيج الدهني.
- أظهرت الخلايا منزوعة التمايز شكلًا ممدودًا يشبه الخلايا الليفية.
- تم الحصول على مجموعات متجانسة من الخلايا من خلال الطرق الموصوفة.
- إثبات إمكانية استخدام الخلايا الدهنية الناضجة كمصدر للخلايا الجذعية.
الاستنتاجات
- يمكن تحويل الخلايا الدهنية الناضجة بفعالية إلى خلايا جذعية متعددة القدرات.
- توفر الطرق الموضحة نهجاً موثوقاً لأبحاث الخلايا الجذعية.
- تساهم هذه الدراسة في فهم اللدونة الخلوية للخلايا الدهنية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يوفر إلغاء تمايز الخلايا الدهنية الناضجة إلى خلايا جذعية متعددة القدرات مصدراً جديداً لتطبيقات الطب التجديدي وهندسة الأنسجة. يتيح هذا النهج توصيفاً دقيقاً لوظائف الخلايا الدهنية وخصائصها الأيضية بناءً على موقع التخزين، مما يدعم التحقق من الأهداف في أبحاث الأمراض الأيضية. وتوفر هذه الطريقة منصة قابلة للتوسع لتوليد خلايا شبيهة بالأرومات الليفية ذات قدرات متعددة مثبتة، مما يسهل تطوير النماذج قبل السريرية وتقليل المخاطر الميكانيكية في اكتشاف العلاجات التي تستهدف الخلايا الدهنية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء مرونة الخلايا الدهنية واختبار الفرضيات العلاجية في مسارات الأمراض الأيضية.
- القيمة التشغيلية: يوفر نظامًا قابلاً للتكرار للتحقق من الأهداف الوظيفية من خلال عزل الخلايا الدهنية النوعية للمخازن الدهنية.
- القيمة العلمية: يدعم الثقة التنبؤية عن طريق إنتاج مجموعات متجانسة من الخلايا منزوعة التمايز لتوضيح المسارات.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير أنظمة بيولوجية مصادق عليها لسير العمل اللاحق من خلال تقنيات هضم الكولاجيناز الموحدة وزراعة السقف.
- القيمة التشغيلية: ضمان توحيد المقايسة وقابليتها للتكرار عبر التحكم في حصيلة الخلايا الدهنية (حوالي 1 مليون خلية لكل جرام من النسيج).
- القيمة العلمية: تمكين التقييم الموثوق للمركبات باستخدام خلايا تشبه الخلايا الليفية مع تأكيد انخفاض تنظيم FABP4 كعلامة على فقدان التمايز.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم تطوير أنظمة ذات صلة بالأمراض لإجراء استقصاءات محددة حول فسيولوجيا الخلايا الدهنية.
- القيمة التشغيلية: يضمن الاستمرارية الترجمية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري، وذلك من خلال قدرة الخلايا الدهنية منزوعة التمايز على الزرع طويل الأمد.
- القيمة العلمية: يسهل اتخاذ قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال إثبات القدرات المتعددة وإمكانيات هندسة الأنسجة لخلايا D-fat.
تكامل مسارات العمل والتدفقات
تتكامل هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشافات، بدءًا من التحقق الأولي من الهدف، مرورًا بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى الدراسات قبل السريرية، ولا سيما في برامج الأمراض الأيضية والطب التجديدي.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتقليل المخاطر البيولوجية من خلال نمذجة تمايز الخلايا الدهنية عكسيًا في المختبر.
- الفحص: يوفر جاهزية المقايسة ومخرجات كمية من خلال عزل الخلايا الموحد وتقييم المورفولوجيا.
- التحليلات: يوفر قراءات قابلة للقياس مثل التغيرات في تعبير FABP4 لمقارنة حالات التمايز العكسي عبر ظروف مختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال إثبات الزراعة طويلة الأمد والقدرة المتعددة للخلايا الدهنية التي خضعت للتمايز العكسي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس قدرة قابلة لإعادة الاستخدام لتوليد خلايا جذعية مشتقة من الخلايا الدهنية عبر تحقيقات متعددة خاصة بمستودعات الدهون.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في عملية تحول النمط الظاهري للخلايا الدهنية.
- القيمة التشغيلية: التوحيد القياسي وقابلية التوسع من خلال بروتوكولات محددة لهضم الكولاجيناز والزراعة المقلوبة.
- القيمة الاستراتيجية: اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف عن المشروع (go/no-go) من خلال تمكين توصيف الخصائص الأيضية الخاصة بمستودعات الدهون قبل تحسين المركبات الرائدة.
- تأثير المحفظة: تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال تقييم متحقق من عائد الخلايا الجذعية وإمكانات التمايز.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في تقنيات عزل الخلايا الدهنية الأولية والهضم باستخدام الكولاجينيز.
- تستلزم بنية تحتية للزراعة الخلوية قادرة على الحفاظ على مزارع سقفية في دوارق مقلوبة أو أطباق ذات 6 آبار.
- تتطلب توحيداً معياريًا بين الفرق لضمان اتساق حصيلة الخلايا الدهنية وتقييم فقد التمايز عبر المختبرات المختلفة.
- تتضمن اعتبارات التكييف عند تطبيق البروتوكول على الأنسجة الدهنية من مستودعات مختلفة أو خصائص مانحين متنوعة.
- تشمل قيوداً عملية مثل الحاجة إلى ملء الوسط بدقة لمنع حدوث اضطرابات ناتجة عن الفقاعات أثناء الزراعة المقلوبة.
