شرطي عبر التشابك الوراثية للبحث عن المفقودين في المخ الجنينية الماوس

الهدف من التجربة التالية هو تصور تطور الدوائر العصبية في دماغ الفأر الجنيني باستخدام ثلاثة أنظمة مميزة لوضع العلامات على الخلايا باستخدام متتبع عبر التشابك يسافر ثنائي الاتجاه ، وتتبع ثان يسافر فقط بطريقة رجعية وملصق ثالث لا ينتقل من الخلية المستهدفة. من الممكن تحديد الخلايا العصبية المستهدفة في المنبع والخلايا العصبية والخلايا العصبية النهائية. توضح النتائج أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول التجريبي لتحليل تكوين الدوائر العصبية في دماغ أنثى الفأر الجنيني بدقة خلية واحدة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي في مجال علم الأعصاب التنموي ، مثل متى تتشكل دوائر عصبية معينة وكيف يتم تنظيمها أثناء التطور الجنيني. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتتبع الدوائر العصبية في الفئران البالغة. على وجه التحديد ، يمكن استخدامه لتحليل النشاط المشبكي بين الخلايا العصبية المحددة وراثيا ، ويمكن استخدامه لتحليل كيف يمكن للظروف التجريبية المختلفة تعديل الدائرة العصبية بمرور الوقت.

ابدأ بفأرة حامل قتلى للرحيم. نظف الجانب البطني من بطنها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم قم بعمل شق رأسي لكشف الأجنة. قم بإزالة سلسلة الأجنة ونقلها إلى طبق من PBS المثلج في الطبق.

قم بإزالة الأجنة الفردية باستخدام ملقط ضعيف. افصل الأجنة الفردية في المحلول باستخدام مقص ناعم وملقط ، وقم بإزالة الأنسجة الزائدة في العملية عندما يتم تنظيف الأجنة بالكامل. خذ خزعة ذيل صغيرة من كل جنين وضعها في أنبوب من محلول التحلل لجمع الحمض النووي لتحديد الجنس والتنميط الجيني.

ثم انقل الجنين إلى مثلج بارد طازج ، 4٪ PFA على الثلج. بعد معالجة كل جنين ، دعهم يحتضنون في PFA مع التحريض لمدة 1.5 ساعة على الأقل ، اعتمادا على حجمهم. عند اكتمال الحضانة.

اغسل المناديل الثابتة ثلاث مرات باستخدام PBS المثلج لمدة خمس دقائق على الأقل لكل غسلة. ثم انقل الأجنة إلى محلول سكروز بنسبة 30٪ ، يحفظ عند أربع درجات مئوية. عندما تغرق الأنسجة بالكامل في المحلول ، استمر في القطع بالتبريد.

أولا ، ابدأ بوضع علامة على قالب التبريد باستخدام علامة مقاومة دائمة للكحول. بعد ذلك ، قم بإعداد ملاط من الثلج الجاف المسحوق في 100٪ من الإيثانول في دلو ثلج باستخدام الملاط لتبريد دورق زجاجي من isop pentane لمدة 10 دقائق تقريبا. أثناء الانتظار ، قم بإزالة المناديل من محلول السكروز وامسح السكروز الزائد بمنديل مختبري قياسي.

ثم انقل الأنسجة إلى قالب تبريد مسمى مسبقا. مع ما يكفي من OCT لتغطية الأنسجة. لا تشكل أي فقاعات هواء في OCT ، خاصة حول الأنسجة.

بعد ذلك ، قم بتوجيه الأنسجة باستخدام ملقط علم الحشرات بوزن الريش لإحداث الحد الأدنى من الضرر. قم بتجميد قوالب التبريد في حمام ISO pentane المبرد دون التسبب في أي بقع إذا لزم الأمر. يمكن تغليف القوالب المجمدة وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لتقسيم القوالب.

قم بتقطيعها إلى أقسام تسلسلية بسمك 14 ميكرون في سلسلة من خمسة. اجمع كل سلسلة من الشرائح الخمس على شريحة زجاجية فائقة الصقيع. عند تحضير حل لهذا البروتوكول ، تأكد من إضافة tween 20 ببطء إلى مخزن TNT المؤقت ، والذي يجب تحضيره طازجا.

ثم اغسل المحلول لأعلى ولأسفل ببطء حتى يمتزج. عند تحضير المخزن المؤقت TNB ، أضف كاشف الحظر ببطء بزيادات صغيرة أثناء التقليب. ثم سخني المحلول إلى 55 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.

سيصبح المحلول حليبي. الآن ، لبدء العمل على الأنسجة ، استخدم أولا مشرط لإزالة OCT الزائد المحيط بأقسام الأنسجة. ثم ضع علامة على حدود كل قسم باستخدام قلم عنق الرحم.

دع الشرائح تصل إلى درجة حرارة الغرفة. ثم اغسلها في درجة حرارة الغرفة ، يجب أن تكون مدة كل غسلة ثلاث مرات خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإخماد نشاط البيروكسيديز الداخلي عن طريق احتضان الشرائح لمدة نصف ساعة في البرد الجليدي ، و 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول.

اتبع ذلك بثلاث غسلات في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل غسلة. ثم احتضان الشرائح لمدة 10 دقائق في PBST لتجعيد الأنسجة. هذه المرة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام مادة تي إن تي.

الآن في غرفة مرطبة ، قم بسد الأنسجة في ما يكفي من TNB لتغطية كل شريحة. اترك الكتلة لمدة نصف ساعة في درجة حرارة الغرفة. لا تدع الشرائح تجف.

بعد تصريف المخزن المؤقت المانع ، قم بتغطية الشريحة بالكامل بالجسم المضاد الأساسي في TNB لربط المتتبع. احتضن لمدة ساعتين في RT أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. لإزالة الجسم المضاد الأساسي ، اغسل الشريحة بمادة تي إن تي ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

أثناء هذه الغسلات ، استخدم بعض التحريض اللطيف. بعد ذلك ، احتضان الأقسام في محلول الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة. في درجة حرارة الغرفة لاحقا ، استخدم ثلاث غسلات من مادة تي إن تي لإزالة الجسم المضاد الثانوي غير المرتبط.

ثم في غرفة رطبة ، قم باحتضان الأنسجة في واحد إلى 100 فجل حصان مترافق هافين بيروكسيداز في TNB لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أثناء غسل الشرائح في مادة تي إن تي. بعد الحضانة ، قم بعمل تخفيف جديد لمحلول TSA. الآن قم بتطبيق تخفيف TSA الطازج على الأنسجة لمدة 10 دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة.

التوقيت الدقيق لحضانة TSA أمرا بالغ الأهمية. لذلك ، لا تحاول معالجة الكثير من الشرائح في وقت واحد في أيدينا. يمكن التعامل مع ما يصل إلى 10 شرائح في خطوة واحدة.

يمكن أن تنتظر الشرائح الإضافية في مخزن غسيل TNT حتى تتم معالجتها بعد جولة أخرى من الغسيل. احتضان الأنسجة مع واحد إلى 500 Alexa الطابق 5 46 تجريد. اجعله مترافقا في TNB لمدة 30 دقيقة.

في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المترافق المجرد مع ثلاثة حمامات TNT أخرى. ثم بالنسبة للتلوين النووي ، ضع محلول 5٪ BIS benza في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وقم بإزالة بقعة BIS benzo بثلاث غسلات TNT. ثم قم بتركيب الشرائح باستخدام fluoro Mount G وتابع تحليلها.

باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم تحليل نضوج الدوائر العصبية التي تنظم محور التكاثر في الفئران التي تحمل أليلات R 26 BIZ و R 26 GTT. تم تنشيط التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا عن طريق إعادة التركيب المعتمد على العقيدة في الخلايا العصبية الجنينية كيسببتين في النواة المقوسة باستخدام خط سائق العقيدة الخاص بكيسببتين ، والتألق المناعي المزدوج لكيس بيبتين باللون الأخضر و BL باللون الأحمر من قبلة. IC R 26 بيز.

يظهر الماوس تنشيط BL في KISS IC R 26 GTT يظهر التألق المناعي المزدوج للماوس KISSPEPTIN باللون الأخضر و GTT الذي تم تنشيطه بواسطة سائق Cree باللون الأحمر. أظهرت هذه التشخيصات وغيرها أن الجينات المعدلة وراثيا كانت تعمل في الأجنة التجريبية E 18.5. تم العثور على الخلايا العصبية الخاصة به في النواة المقوسة تتواصل بالفعل مع GNRH.

الخلايا العصبية تفتقر إلى Z محصورة في CRE التي تعبر عن الخلايا العصبية كيسببتين بينما تم نقل BL عبر المشبكي إلى الخلايا العصبية الأولية والمصب. البعض ، ولكن ليس كلها. احتوت الخلايا العصبية GNRH على bl.

وبالتالي ، فإن مجموعة فرعية فقط من الخلايا العصبية GNRH الجنينية مرتبطة بشكل متشابك بالخلايا العصبية للنواة المقوسة. لم تحتوي الخلايا العصبية GNRH على التتبع الرجعي. GTT مما يدل على أن هذه الخلايا العصبية هي في اتجاه مجرى الخلايا العصبية كيسببتين.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في يوم واحد بعد هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل التألق المناعي المزدوج لتحديد الطبيعة الكيميائية الحيوية للخلايا العصبية المتصلة. يجب أن تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب وعلم الأحياء التنموي لاستكشاف الاتصال العصبي بدقة خلية واحدة أثناء التطور وفي البالغة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور تكوين ونضج الدوائر العصبية في الفئران.