الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مزارع نموذجية لخلايا القرنية لسمك الزرد لاستخدامها في دراسات الهجرة الجماعية للخلايا ودراسات التئام الجروح الظهارية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة القشور ذات الأنسجة الظهارية المرفقة أولا من سمك الزرد البالغ المخدر. توضع المقاييس ذات الأنسجة المرفقة في طبق مزرعة للسماح للخلايا بالالتصاق.

ثم يضاف وسط الاستزراع مع أي علاجات يشير إليها التصميم التجريبي. أخيرا ، يتم احتضان الخلايا ومراقبتها بواسطة الفحص المجهري بالفيديو للإطار الزمني المطلوب. في النهاية ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من المقايسات لإثبات التغييرات في الهجرة أو التشكل الخلوي ، بالإضافة إلى التعبير عن البروتينات أو العلامات الأخرى بمرور الوقت.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية ، مثل طريقة زراعة الخلايا التحويلية ، هي أن ثقافة الزرع الأولية ، والتي تعيد تجميعها بشكل وثيق مع خصائص الخلية في الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التئام الجروح الظهارية ، مثل دور الهجرة الجماعية والانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن المقاييس قد لا تلتصق بسطح النمو أو قد تفشل في النمو في أي طبق ثقافة معين.

سيظهر هذا الإجراء خوسيه راب بانين ، طالب الطب ، شانا تي آي وأجنيس باسكوال ، وكلاهما من كبار الباحثين الزملاء في مختبري. للتحضير لهذه التجربة ، قم بإزالة الكلور ما يقرب من 1.5 لتر من ماء الصنبور إما باستخدام عامل إزالة الكلور التجاري أو عن طريق ترك الماء يقف لمدة 24 ساعة ، ثم استخدم 500 مل لملء كل من الأكواب الثلاثة سعة لتر واحد. قم بتسمية دورق واحد لحمل الأسماك قبل أي إجراء ، وآخر آخر للتعافي من الدورق الثالث.

أضف 100 ميكروغرام لكل مليلتر من التراكا. لتخدير الأسماك ، املأ صينية ضحلة بالثلج. قم بتسخين الثقافة المتوسطة إلى درجة حرارة الغرفة واجمع ملاقط المجوهرات النظيفة.

نظف الملقط عن طريق غمر الأطراف في 70٪ من الإيثانول وتمريرها عبر موقد بنسن ، مما يسمح للإيثانول بالاحتراق. اصطاد العدد المطلوب من الأسماك وضعها في دورق تعليق. انقل سمكة واحدة إلى دورق التخدير.

بعد تخدير السمكة وفقا لبروتوكول النص ، انقلها إلى الثلج وضعها أفقيا مع مواجهة الذيل لليد التي تمسك الملقط. لإزالة المقاييس ، ضع الملقط بالتوازي مع الأسماك. مع وجود الطرف على حافة المقياس ، اضغط على الجانب المسطح من الملقط قليلا في جانب السمكة لجعل المقياس يرتفع من جسم السمكة.

استخدم الملقط للإمساك بالميزان ، ثم نتفعه ودون قلبه ، ضعه في طبق زراعة الأنسجة. كرر الإجراء ، وقم بإزالة 12 قشورة كحد أقصى من شخص بالغ كبير ، وتجنب منطقة الخياشيم والخط الجانبي والزعانف. ضع السمكة في دورق الاسترداد وراقبها للتأكد من تعافيها من آثار التخدير.

ثم انقل الأسماك إلى حوض فردي واترك الأسماك تتعافى لمدة 21 يوما للسماح بالتجدد الكامل للقشرة. اعتمادا على التجربة ، ضع ما يصل إلى 20 مقياسا لكل بلاستيك. طبق معالج بزراعة الأنسجة 35 ملم ، أو أربعة إلى ستة مقاييس لكل كوب.

الطبق السفلي ، اسمح للمقاييس بالالتصاق بالطبق قبل إضافة 1.2 مل من الوسط الكامل برفق إلى كل طبق ثقافة. احتضان مزارع X explan عند 28 درجة مئوية للفترة الزمنية المطلوبة مع أو بدون علاج لإجراء الفحص المجهري. بعد إزالة طبق يحتوي على صفائح خلوية من الحاضنة ، ضعه في مرحلة المجهر.

استخدم هدف أربعة x للتركيز في البداية لتسهيل التقاط الصور بمرور الوقت. حدد موقع كل ورقة خلية و / أو اتجاه الطبق على المسرح. قم بتصوير أوراق الخلايا في نقاط زمنية مختلفة وفقا للبروتوكول التجريبي ، وإذا كانت هناك حاجة فقط إلى الصور الثابتة للتجربة التي يتم وضعها مرة أخرى في الحاضنة.

لإصلاح عينات للفحص المجهري المناعي ، قم بإعداد المحاليل وتسخينها مسبقا في درجة حرارة الغرفة. لعرض مواقع OSE تحت التألق ، استخدم أطباق ثقافة الأطباق ذات القاع الزجاجي مقاس 35 ملم لزراعة الباذنجان كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، دون إزالة وسط الاستزراع ، أضف 0.8 مل من 4٪ بارالديهايد في 1.1 XPBS إلى كل طبق. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

ثم استنشق المحلول. أضف 0.8 مل إضافي من المثبت إلى كل طبق ، وبعد حضانة ثانية لمدة خمس دقائق ، استنشق المحلول. ما لم تستخدم روابط أو حواتم خارجية ، قم بتجشير الخلايا بإضافة 0.5 مل من 0.2٪ TRITTON X 100 في احتضان XPBS واحد لمدة خمس دقائق.

قبل إزالة المحلول ، أضف 0.5 مل من 1٪ BSA في XPBS واحد ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أو عند أربع درجات مئوية طوال الليل بعد الحضانة ، واستنشق المحلول واستمر في تلطيخ الأجسام المضادة. بدلا من ذلك ، أضف ملليلترا إلى ملليلترين من 1٪ BSA في XPBS واحد وقم بتخزينه في أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع. تنفيذ التألق المناعي.

وفقا لبروتوكول النص كما هو موضح هنا ، يمكن ملاحظة صفائح من الخلايا القرنية تهاجر من تحت المقياس في غضون ساعات من إنشاء ثقافة EXPLAN. من حين لآخر ، يمكن ملاحظة خلية كيراتينية مهاجرة بشكل فردي ، والتي انفصلت عن ورقة الهجرة الجماعية. المعدل الأولي لتقدم الورقة سريع للغاية ، لكن هذا المعدل يتباطأ بسرعة مع انتشار الخلايا خلال أول 48 ساعة من الزراعة.

لا ترتبط الزيادة السريعة بتكاثر الخلايا لأنه بعد وضع العلامات لمدة 24 ساعة باستخدام EDU الفلوري ، يظهر ما يقرب من 10٪ من الخلايا دليلا على انقسام الخلايا بمعدل أقل بكثير مما شوهد في خطوط الخلايا المحولة. عند إضافة العلاج في الوقت الذي يتم فيه إنشاء X explan ، فإن بعض المركبات تغير الهجرة الجماعية للخلايا. على سبيل المثال ، كما هو موضح هنا ، تقلل بعض مثبطات MMP من مساحة ورقة الخلية بعد 24 ساعة.

في الثقافة ، عندما تتم إضافة الببتيد القابل للذوبان RGD إلى وسط الاستزراع لتعطيل تكوين الالتصاق ، فإن الحافة الأمامية للورقة تتقلص بسرعة وبالتالي تنفصل الحافة الأمامية للورقة وتتراجع وأقل من دقيقتين لتقييم توطين البروتينات داخل الصفيحة أو داخل لتر وخلايا تابعة ، يمكن تثبيت الورقة بأكملها وتلطيخها كما هو موضح في هذا الشكل. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 10 إلى 15 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إضافة وسائط ثقافة التدفئة فقط بعد إتاحة الوقت للخلايا للالتزام بطبق الثقافة باتباع هذا الإجراء.

يمكن تنفيذ طريقة أخرى مثل QPCR للإجابة على أي سؤال إضافي ، مثل التغيرات في التعبير الجيني فيما يتعلق بالوقت و / أو حالة العلاج. بعد مشاهدة هذا الإجراء ، يجب أن يكون لديك فكرة أفضل بكثير عن كيفية إنشاء ثقافات IDE explan لاستخدامها في مجموعة متنوعة من الإجراءات.