دليل لتوليد واستخدام hiPSC الشخصيات المستمدة لدراسة الأمراض العصبية
فبراير 21, 2015
يصف هذا البروتوكول كيف يمكن تمييز الخلايا السلفية العصبية عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، من أجل إنتاج مجموعة خلايا عصبية قوية وقابلة للتكرار ، والتي يمكن استخدامها لتحديد المسارات التنموية التي تساهم في التسبب في المرض في العديد من الاضطرابات العصبية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا سلفية عصبية أو NPCs من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية أو PSCs العالية كمنصة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية للمساهمة في الأمراض العصبية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التمييز أولا بين PSCs العالية باستخدام مثبطات smad المزدوجة إلى وريدات عصبية. الخطوة الثانية هي حصاد هذه الوريدات العصبية والسماح لها بالنمو لتصبح مجموعات N PC قابلة للتوسيع.
التالي نقل الفيروسات مع عدوى تدور. يتم استخدام خطوة لتحسين الكفاءة لمعالجة التعبير الجيني. الخطوة الأخيرة هي تنمية الشخصيات غير القابلة للعب في حالة تعليق بحيث تشكل تلقائيا مجالات عصبية.
في النهاية ، يمكن استخدام هذه المنصة لفحص مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية الخلوية. على سبيل المثال ، قياس تأثير التلاعب الجيني على الهجرة العصبية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للآليات الخلوية مثل الهجرة.
يمكن أيضا تطبيقه لدراسة العمليات البيولوجية الأخرى مثل النسخ المتماثل والإجهاد التأكسدي وموت الخلايا المبرمج ونمو الخلايا العصبية. يؤدي تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان أو الخلايا الجذعية العصبية العالية إلى تكوين وريدات عصبية مرئية ، والتي تتميز بأنها مجموعات مستديرة من الخلايا الظهارية العصبية ذات القطبية القاعدية aico للاختيار الأنزيمي للوريدات العصبية في اليوم 14. استنشق الوسائط من أجسام الجنين الملتصقة أو ebs وأضف ملليلترا واحدا من كاشف اختيار الروسيت العصبي لكل بئر من ستة ألواح احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد ساعة واحدة. استخدم رجل ماصة P 1000 لإزالة الإنزيم برفق من كل بئر وإضافة مليلتر واحد من D-M-E-M-F 12 لكل بئر. لغسل الوريدات ، اجمع المليلتر الواحد من D-M-E-M-F 12 وطرده بسرعة مرة أخرى إلى البئر ، وبالتالي فصل الوريدات عن اللوحة.
اجمع الوريدات في أنبوب صقر ، ماصة أخرى ، ملليلتر واحد من D-M-E-M-F 12 ، وطردها بسرعة في نفس البئر لفصل الوريدات المتبقية. لا تحاول أن تكسر مجاميع الوردة. اجمع الوريدات العصبية في نفس أنبوب الصقر.
يمكن إضافة المزيد من الإنزيم وتكرار هذا الإجراء إذا لم تنفصل الوريدات بسهولة عند جمع جميع الوريدات العصبية. قم بتدوير أنبوب فالكون على 300 جم لمدة ثلاث دقائق. استنشق الغسيل وإعادة الظهر.
الوريدات في ملليلترين من وسائط الخلية السلفية العصبية. انقل الخلايا إلى ستة ألواح جدران مطلية بستة ألواح من البولي إل أورنيثين ، وتنمو عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد. في هذا المختبر ، تزرع الخلايا السلفية العصبية أو الشخصيات غير القابلة للعب على ألواح ماتريجيل ، وتتغذى كل يومين ويتم الحفاظ عليها بكثافة عالية جدا.
لتقسيم الشخصيات غير القابلة للعب ، قم أولا بشفط الوسائط ثم أضف ملليلترا واحدا من الأكوتان الدافئ لكل بئر من ستة ألواح احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. انقل الخلايا المنفصلة برفق إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على D-M-E-M-F 12 بأقل قدر ممكن من الضغط الميكانيكي. لا تقم بتقليب الخلايا أثناء وجودها في إنزيم بيليه الخلايا عن طريق الدوران عند 1000 غرام لمدة خمس دقائق بعد الطرد المركزي ، وشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الشخصيات غير القابلة للعب.
في حوالي ملليلتر واحد من وسائط NPC لكل بئر أصلي من ستة آبار صفيحة ، من المتوقع أن يكون من خمسة إلى 10 ملايين خلية لكل بئر ملتقى من ستة آبار صفيحة بعد إعادة التعليق وعد الخلايا. أعد لوحة الشخصيات غير القابلة للعب ما يقرب من مليون إلى 2 مليون خلية لكل بئر من ستة آبار صفيحة للحفاظ على الشخصيات غير القابلة للعب. تختلف كفاءة تكوين المجالات العصبية بين التجربة وخطوط الخلايا ، ولكنها عادة ما تحدث بشكل أفضل إذا تم وضع ما بين 200 و 000 ومليون خلية في كل بئر من صفيحة غير ملتصقة بستة جدران في حالة حدوث تكتل ، قلل من عدد الخلايا الجالسة بشكل مثالي في غضون يوم إلى يومين من الانقسام.
يجب نقل NP NPCs مع نواقل الفيروسات العدسية أو الفيروسات القهقرية لزيادة النسبة المئوية للخلايا المنقولة. استخدم عدوى الدوران. استنشاق الوسائط من كل بئر واستبدالها بالإفراط في التعبير أو التحكم في فيروسات العدسات أو الفيروسات القهقرية ذات الصلة التي يتم تخفيفها إلى التعدد المطلوب من العدوى المخففة.
في وسائط NPC ، استخدم 1.5 مل لكل بئر من ستة ألواح تدور عند 1000 جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في جهاز طرد مركزي لوحة. بعد الدوران ، ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة لتقليل الموت الخلوي. استبدل الوسائط في غضون ثماني ساعات من الإصابة بالدوران.
ابدأ هذا الإجراء عن طريق غسل المجالات العصبية المشتقة من NPC مرة واحدة في وسائط NPC لإزالة الحطام الخلوي. قم بإمالة اللوحة بزاوية 45 درجة واسمح للمجالات العصبية بالاستقرار ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط دون شفط المجالات العصبية. استبدلها بوسائط جديدة.
بعد ذلك ، اختر يدويا المجالات العصبية المشتقة من NPC تحت المجهر باستخدام ماصة P 200 لنقل كرة عصبية واحدة إلى كل بئر من لوحة بئر 96 مطلية ب matrigel. من المهم اختيار المجالات العصبية ذات الأحجام المتشابهة من أجل تقليل التباين في النتائج. أضف 0.5 ملليغرام إضافي من هلام ماتري المخفف في وسائط NPC الباردة إلى المجالات العصبية في كل لوحة 96 بئر.
باستخدام طرف ماصة ، قم بتوسيط كل مجال عصبي فردي يدويا في منتصف البئر ، والسماح بهجرة المجال العصبي لمدة 48 ساعة. بعد تثبيت الخلايا وتلطيخها بالعلامات الكيميائية المناعية المطلوبة ، قم بتصوير المجالات العصبية بالكامل باستخدام هدف مجهر الفوركس. لقياس الترحيل الشعاعي، استخدم برنامج الصورة J.
استخدم أداة التحديد اليدوي لتتبع حافة أبعد الخلايا المهاجرة يدويا. تأكد من تحديد هذه المنطقة في نافذة تعيين القياسات الموجودة ضمن علامة التبويب تحليل. ثم استخدم دالة القياس لحساب مساحة الشكل الناتج.
استخدم قيمة قياس المساحة ومعادلة مساحة الدائرة لتحديد نصف القطر الخارجي بنفس الطريقة ، وتتبع حافة المجال العصبي الأصلي. قم بقياس المساحة وحساب نصف القطر الداخلي. احسب إجمالي الهجرة الشعاعية كفرق بين نصف القطر الخارجي والداخلي.
تظهر هذه الصور مراحل التمايز العصبي العالي PSC من PSCs العالية إلى أجسام الأجنة ، والوريدات العصبية ، والشخصيات غير القابلة للعب ، والخلايا العصبية التي تم التحقق من صحتها عبر عن NPCs ، وتعشيش علامة NPC وعامل نسخ الخلايا الجذعية العصبية SOX اثنين في معظم الخلايا. يظهر تلطيخ بيتا ثلاثة توبولين أيضا في جميع مجموعات NPC. تعبر الشخصيات غير القابلة للعب أيضا عن عامل نسخ الخلايا الجذعية العصبية PAC ستة وعلامة سلف الدماغ الأربعة.
يمكن أن تتمايز TBR اثنان ، ولكن ليس علامات الدماغ المتوسط مثل LMX one A و FOX A ، ويمكن أن تتمايز الخلايا النجمية غير القابلة للعب إلى 70 إلى 80٪ بيتا ، وثلاثة خلايا عصبية إيجابية للتوبولين ، كما هو موضح باللون الأخضر و 20 إلى 30٪ من الخلايا النجمية الإيجابية للبروتين الحمضي الدبقي الموضحة باللون الأحمر ، PSC عالي الجودة. تعبر الشخصيات غير القابلة للعب عن neston و SOX اثنين في معظم الخلايا ، في حين أن الشخصيات غير القابلة للعب منخفضة الجودة تحتوي على بقع من SOX اثنين سلبية وتعش في الخلايا السالبة فقط. تعبر الخلايا العصبية البالغة من العمر أربعة أسابيع عن الشخصيات غير القابلة للعب عالية الجودة عن خريطة اثنين AB وبيتا ثلاثة مضطربة.
بعد التحويل الناجح باستخدام ناقل فيروسي عدسي أو قهقري عيار عالي العيار. يتم تصنيف أكثر من 80٪ من الخلايا بواسطة مراسل الفلورسنت. ينتج عن توليد المجال العصبي المتجه مجموعة من المجالات العصبية ذات الحجم المتجانس نسبيا ، والتي يمكن أن تظل صحية في الثقافة لمدة أسبوع تقريبا.
مع التغذية المنتظمة للخلايا العصبية ، تحدث هجرة الكرة بقوة في المجالات العصبية السليمة كما يتضح من هذه الصور الساطعة قبل وبعد 48 ساعة من الهجرة في ماتريجيل بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفصام لاستكشاف الهجرة العصبية في الخلايا الجذعية المشتقة من PL المستحثة من الإنسان. لا تنس أن العمل مع الفيروس القهقري يمكن أن يكون خطيرا ويجب أن تتم جميع أعمال زراعة الأنسجة في BL two plus الحالات عندما يكون الفيروس موجودا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يصف هذا البروتوكول تمايز الخلايا السلفية العصبية (NPCs) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) لدراسة الأمراض العصبية. يتضمن العملية توليد الخلايا السلفية العصبية التي يمكن توسيعها والتعامل معها لأغراض البحث.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الاضطرابات العصبية
الخلفية
- يمكن أن تتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) إلى أنواع مختلفة من الخلايا.
- الخلايا السلفية العصبية (NPCs) ضرورية لدراسة تطور الدماغ والمرض.
- يمكن أن يوفر فهم مسارات تمايز الخلايا السلفية العصبية رؤى حول الاضطرابات العصبية.
- يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء مصدر موثوق للخلايا السلفية العصبية للبحث.
غرض الدراسة
- لتوليد الخلايا السلفية العصبية من hiPSCs لدراسة الأمراض العصبية.
- لاستكشاف الآليات الخلوية والجزيئية المتورطة في تطور المرض.
- لتوفير منصة للبحث المستقبلي حول اضطرابات النمو العصبي.
الطرق المستخدمة
- تمايز hiPSCs باستخدام مثبطات SMAD المزدوجة إلى وريدات عصبية.
- حصاد الوريدات العصبية لتنمية مجموعات الخلايا السلفية العصبية القابلة للتوسع.
- النقل الفيروسي العدسي مع العدوى الدوارة لتعديل التعبير الجيني.
- زراعة الخلايا السلفية العصبية في تعليق لتشكيل الكرات العصبية.
النتائج الرئيسية
- تم التمايز الناجح للخلايا السلفية العصبية من hiPSCs.
- أُنشئت مجموعات من الخلايا السلفية العصبية قابلة للتوسع للبحث.
- تم إثبات فعالية النقل الفيروسي العدسي.
- شكلت الخلايا السلفية العصبية كرات عصبية في ثقافة تعليق.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لتوليد الخلايا السلفية العصبية من hiPSCs.
- يمكن استخدام الخلايا السلفية العصبية للتحقيق في آليات الأمراض العصبية.
- يمكن أن يسهل هذا النهج البحث الإضافي في الاستراتيجيات العلاجية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to model early neurodevelopmental events in human cells, providing a scalable platform to interrogate disease mechanisms prior to symptom onset. By generating expandable, genetically tractable NPCs from patient-derived hiPSCs, teams can de-risk target hypotheses through empirical testing of gene manipulation effects on cellular phenotypes such as migration, replication, oxidative stress, and apoptosis. This supports predictive confidence in target validation and informs go/no-go decisions in preclinical neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing molecular consequences of gene expression changes in a human-derived neural system.
- Operational Value: Provides a renewable NPC source for consistent phenotypic screening across genetic perturbations.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking genetic manipulation to quantifiable cellular outcomes relevant to neurological disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates neurosphere-forming NPC populations suitable for high-content migration and stress-response assays.
- Operational Value: Enables standardized, scalable neurosphere production for reproducible compound or genetic screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces expandable NPCs that can be cryopreserved, passaged, and transitioned to suspension culture for longitudinal phenotypic monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by modeling human neurodevelopmental processes in a dish.
- Disease-Relevant System: Uses patient-derived NPCs to capture genetic background effects on cellular phenotypes, enhancing clinical relevance.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early assessment of target modulation effects on neuronal differentiation and glial fate, informing safety and efficacy profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing a human cellular system to validate targets before committing to medicinal chemistry campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target de-risking by enabling controlled manipulation of gene expression in NPCs and measurement of downstream phenotypic effects.
- Screening: Delivers assay-ready NPCs and neurospheres for quantifying impacts on migration, replication, oxidative stress, and apoptosis following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Generates imaging-based migration metrics (e.g., radial distance via ImageJ) and fluorescent reporter readouts to assess transduction efficiency and phenotypic changes.
- Translational Research: Maintains developmental and disease relevance by using patient-derived cells to model early pathogenic events in neurological disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable NPC platform that can be reused across multiple targets, genetic backgrounds, and phenotypic assays within a neuroscience discovery portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing reliance on post-mortem or non-human models through direct empirical testing in human neural progenitors.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized NPC expansion, cryopreservation, and neurosphere formation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, reducing late-stage failure due to unanticipated biological mechanisms in human neurons.
- Portfolio Impact: Facilitates data-driven prioritization of targets based on phenotypic rescue or exacerbation in a clinically relevant human cellular system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neural differentiation, and lentiviral transduction techniques.
- Depends on access to poly-L-ornithine/laminin or Matrigel-coated surfaces, neural progenitor media, and centrifugation equipment for rosette harvesting and NPC splitting.
- Necessitates standardized protocols for neurosphere formation and migration assays to minimize variability across experiments and cell lines.
- Requires biosafety level 2-plus conditions when working with lentiviral or retroviral vectors to ensure safe handling.
- Success depends on careful handling to avoid rosette breakage during harvesting and maintaining optimal seeding densities for neurosphere formation.
