دليل لتوليد واستخدام hiPSC الشخصيات المستمدة لدراسة الأمراض العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا عصبية سلفية (NPCs) من خلايا جذعية بشرية مستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) لتكون بمثابة منصة لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية التي تساهم في الأمراض العصبية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تمايز خلايا hiPSCs باستخدام مثبطات smad المزدوجة إلى وردات عصبية. وتتمثل الخطوة الثانية في حصاد هذه الوردات العصبية والسماح لها بالنمو إلى مجموعات من الـ NPCs القابلة للتوسع.

تلي ذلك عملية ترنسدكشن فيروسي لينتي (lentiviral transduction) باستخدام تقنية العدوى بالدوران (spin infection). وتُستخدم هذه الخطوة لزيادة الكفاءة في التحكم في التعبير الجيني. أما الخطوة النهائية فهي تنمية الخلايا السلفية العصبية (NPCs) في حالة تعليق بحيث تشكل كرات عصبية (neurospheres) بشكل تلقائي.

في نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه المنصة لتحليل مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية الخلوية. على سبيل المثال، قياس تأثير التعديل الوراثي على الهجرة العصبية. ومع ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة في الآليات الخلوية مثل الهجرة.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً لدراسة عمليات بيولوجية أخرى مثل التضاعف، والإجهاد التأكسدي، والموت الخلوي المبرمج، ونمو neurite. ويؤدي تمايز الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات أو high PSCs إلى تكوين وردات عصبية مرئية، والتي تتميز بأنها تجمعات مستديرة من الخلايا الظهارية العصبية ذات قطبية apical-basal، وذلك للاختيار الإنزيمي للوردات العصبية في اليوم 14. اسحب الوسط من الأجسام الجنينية الملتصقة أو ebs وأضف 1 mL من كاشف اختيار الوردات العصبية لكل بئر في طبق سداسي الفجوات، ثم حضنها عند 37 °C لمدة ساعة واحدة.

بعد مرور ساعة واحدة، استخدم ماصة P 1000 لإزالة الإنزيم برفق من كل بئر، ثم أضف 1 mL من D-M-E-M-F 12 في كل بئر. ولغسل الروزيتا، اجمع الـ 1 mL من D-M-E-M-F 12 ثم اطردها بسرعة مرة أخرى داخل البئر، وذلك لفصل الروزيتا عن الطبق.

اجمع الوردات العصبية في أنبوب فالكون. استخدم الماصة لسحب 1 mL أخرى من D-M-E-M-F 12 ثم قم بتفريغها بسرعة في نفس البئر لفصل ما تبقى من الوردات العصبية. لا تقم بالترتيب (trituration) وحاول تجنب تفتيت تجمعات الوردات العصبية. اجمع الوردات العصبية في أنبوب الفالكون نفسه.

يمكن إضافة المزيد من الإنزيم وتكرار هذا الإجراء إذا لم تنفصل الروزيتا (rosettes) بسهولة بعد جمع كافة الروزيتا العصبية. يتم تدوير أنبوب Falcon بسرعة 300 G لمدة ثلاث دقائق. ثم يتم سحب سائل الغسيل وإعادة التعليق.

قم بتعليق الوردات (rosettes) في 2 mL من وسط استنبات الخلايا السلفية العصبية. انقل الخلايا إلى طبق سداسي الفجوات مغطى بطبقة من poly L ornithine، واتركها لتنمو عند 37 °C لمدة أسبوع واحد. في هذا المختبر، تُنمى الخلايا السلفية العصبية أو NPCs على أطباق matrigel، وتُغذى كل يومين مع الحفاظ عليها بكثافة عالية جداً.

لفصل الخلايا السلفية العصبية (NPCs)، قم أولاً بشفط الوسط الغذائي، ثم أضف 1 mL من مادة accutane الدافئة لكل بئر في طبق سداسي الفتحات (six Well plate)، وحضنها عند 37 °C لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. انقل الخلايا المنفصلة بلطف إلى أنبوب سعة 15 mL يحتوي على DMEM/F12، مع تقليل الإجهاد الميكانيكي قدر الإمكان. لا تقم بعملية التقطير (tritration) للخلايا. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1000 ×g لمدة خمس دقائق، وبعد الطرد المركزي، اشفط السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا السلفية العصبية (NPCs).

في حوالي 1 mL من وسط NPC لكل بئر أصلي في طبق سداسي الآبار، يتوقع وجود 5 إلى 10 مليون خلية لكل بئر متراص في طبق سداسي الآبار بعد إعادة التعليق وعد الخلايا. استبدل طبق NPCs بنحو 1 إلى 2 مليون خلية لكل بئر في طبق سداسي الآبار للحفاظ على NPCs. تختلف كفاءة تكوين الكرات العصبية بين التجارب والخطوط الخلوية، ولكنها تحدث عادةً بشكل أفضل إذا تم وضع ما بين 200,000 ومليون خلية لكل بئر في طبق سداسي الآبار غير لاصق؛ وفي حال حدوث تكتل، قلل عدد الخلايا الموضعة. ويفضل أن يتم ذلك خلال يوم إلى يومين من عملية التقسيم.

يجب نقل العدوى إلى خلايا NP NPCs باستخدام ناقلات فيروسية بطيئة (lentiviral) أو ناقلات فيروسية قهقرية (retroviral) لزيادة نسبة الخلايا التي تم نقل الجينات إليها. استخدم طريقة العدوى بالتدوير (spin infection). قم بشفط الوسط من كل بئر واستبدله بالفيروسات البطيئة أو القهقرية المناسبة للإفراط في التعبير الجيني أو فيروسات التحكم، بحيث تكون معايرة وفقاً لتعدد العدوى (multiplicity of infection) المطلوب والمخفف.

في وسط NPC، استخدم 1.5 milliliters لكل بئر من طبق سداسي الآبار، ثم قم بالتدوير بسرعة 1000 G في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة باستخدام جهاز طرد مركزي للأطباق. بعد عملية التدوير، أعد الطبق إلى الحاضنة لتقليل موت الخلايا. استبدل الوسط خلال ثماني ساعات من عملية العدوى بالتدوير.

ابدأ هذا الإجراء بغسل الكريات العصبية (NEUROSPHERES) المشتقة من الخلايا السلفية العصبية (NPC) مرة واحدة في وسط زراعة NPC لإزالة الحطام الخلوي. أمل الطبق بزاوية 45 درجة واترك الكريات العصبية تترسب، ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط دون شفط الكريات العصبية. استبدله بوسط زراعة جديد.

بعد ذلك، قم بالتقاط الكرات العصبية (NEUROSPHERES) المشتقة من الخلايا السليفة العصبية (NPC) يدويًا تحت المجهر باستخدام ماصة P 200، وانقل كرة عصبية واحدة إلى كل بئر من آبار لوحة 96 بئرًا المطلية بالماتريجيل (matrigel). من المهم اختيار كرات عصبية ذات أحجام متماثلة لتقليل التباين في النتائج. أضف 0.5 milligrams إضافية من الماتريجيل (matrigel) المخفف في وسط NPC البارد إلى الكرات العصبية في كل لوحة 96 بئرًا.

باستخدام رأس ماصة، قم بتوسيط كل كرة عصبية بشكل يدوي في منتصف البئر. اترك الكرات العصبية لتهاجر لمدة 48 ساعة. بعد تثبيت الخلايا وصبغها بالعلامات الكيميائية النسيجية المناعية المطلوبة، قم بتصوير الكرات العصبية بالكامل باستخدام عدسة مجهر Forex. لقياس الهجرة الشعاعية، استخدم برنامج Image J.

استخدم أداة التحديد الحر لتتبع حواف الخلايا الأكثر هجرة يدوياً. تأكد من تفعيل خيار المساحة (area) في نافذة القياسات المحددة الموجودة تحت علامة تبويب التحليل (analyze). ومن ثم استخدم وظيفة القياس (measure) لحساب مساحة الشكل الناتج.

استخدم قيمة قياس المساحة ومعادلة مساحة الدائرة لتحديد نصف القطر الخارجي بنفس الطريقة، ثم تتبع حافة كرة neuros الأصلية. قم بقياس المساحة وحساب نصف القطر الداخلي. احسب إجمالي الهجرة الشعاعية باعتباره الفرق بين نصفي القطر الخارجي والداخلي.

تُظهر هذه الصور مراحل التمايز العصبي للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (PSC) من خلايا PSC إلى الأجسام الجنينية، والوريدات العصبية، والخلايا السلفية العصبية (NPCs)، والعصبونات. وتُظهر الخلايا السلفية العصبية الموثقة تعبيراً عن علامة NPCs، وعامل نسخ الخلايا الجذعية العصبية SOX2 في معظم الخلايا. كما يظهر صبغ Beta three tubulin في جميع مجموعات NPCs. وتعبر الـ NPCs أيضاً عن عامل نسخ الخلايا الجذعية العصبية PAX6 وعلامة سلف الدماغ four brainin.

يمكن للخلايا السلفية العصبية (NPCs) التي تعبر عن TBR2 ولكن لا تعبر عن علامات الدماغ المتوسط مثل LMX1A و FOXA2، أن تتمايز بنسبة 70 إلى 80% إلى عصبونات إيجابية لـ beta three tubulin (الموضحة باللون الأخضر) وبنسبة 20 إلى 30% إلى خلايا نجمية إيجابية لـ glial fibrillary acidic protein (الموضحة باللون الأحمر) في حالة الخلايا السلفية العصبية ذات الجودة العالية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC). تعبر الخلايا السلفية العصبية عالية الجودة عن neston و SOX2 في معظم الخلايا، بينما تحتوي الخلايا السلفية العصبية منخفضة الجودة على بقع من الخلايا السلبية لـ SOX2 و nestin فقط. أما العصبونات البالغة من العمر أربعة أسابيع والتي تمايزت من خلايا سلفية عصبية عالية الجودة، فهي تعبر عن map2 AB و beta three tubulin.

بعد إتمام عملية التنصيب الناجحة باستخدام ناقل فيروسي بطيء (lentiviral) أو فيروسي قهقري (retroviral) ذو عيار مرتفع، يتم وسم أكثر من 80% من الخلايا بواسطة المراسل الفلوري. ويؤدي توليد الكرات العصبية (neurospheres) باستخدام الناقل المضمن إلى الحصول على مجموعة من الكرات العصبية ذات حجم متجانس نسبيًا، والتي يمكن أن تظل سليمة في المزرعة لمدة أسبوع تقريبًا.

مع التغذية المنتظمة، تحدث هجرة الكرات العصبية بقوة في الكرات العصبية السليمة كما توضح صور المجهر الضوئي هذه قبل وبعد 48 ساعة من الهجرة في matrigel بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال انفصام الشخصية لاستكشاف الهجرة العصبية في الخلايا السلفية العصبية NPCs المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المحفزة متعددة القدرات iPSC. لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات القهقرية قد يكون خطيراً، ويجب إجراء جميع أعمال الزراعة النسيجية في ظروف BL2+ عند احتمال وجود الفيروس.