التلاعب و في المختبر نضوج القيطم المورق البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

الهدف من التجربة التالية هو تدمير بروتينات الأم المخزنة في البويضات أو الإفراط في التعبير عن البروتينات ذات الأهمية عند نقطة إخصاب بيض الضفادع. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن oligos antisense أو mRNA في البويضات غير الناضجة غير المنظمة إنزيميا لتحلل أو الإفراط في التعبير عن بروتين معين. كخطوة ثانية ، يتم نقل البويضات إلى وسط يحتوي على هرمون البروجسترون ، مما يؤدي إلى نضوج البويضات إلى البيض.

بعد ذلك ، يتم حقن المنوية في البويضات الناضجة في المختبر من أجل مراقبة تأثير الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير على التطور الجنيني. في النهاية ، فإن تطوير البويضات المحقونة oligo في الضفادع الصغيرة السباحة هو الاختبار الوظيفي للضربة القاضية الجينية أو الإفراط في التعبير. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأوعية الموجودة مثل المضيف للنقل ، هي أنه يمكننا تخطي عملية جراحة الضفدع باستخدام البروتوكولات القياسية.

اجمع تأليفا على SAC يحتوي على خلايا صحية في طبق بترو يبلغ طوله تسعة سنتيمترات يحتوي على MBS plus ps. ثم قم بتقسيم المبيض إلى قطع مربعة بعرض سنتيمتر إلى سنتيمترين. اجمع حوالي خمسة ملليلتر من المبيض الممزق مع الخلايا في أنبوب جديد سعة 50 مل.

ثم اشطف المناديل باستخدام MBS plus PS عدة مرات ، واجمع البيض في 15 مل من MBS الطازج بالإضافة إلى ps. الآن ، أضف سبع وحدات من إنزيم تساقط الأوراق إلى المعلق واحتضن المعلق بنباتات لطيفة حتى تتساقط أوراقها جزئيا على الأقل. سيستغرق هذا ساعة على الأقل بعد الحضانة.

املأ الأنبوب ب MBS plus Ps لإيقاف التفاعل. اسحب المحلول على جدار الأنبوب وليس مباشرة على السيوت. دع المناديل تستقر وتخلص من الحساء والعامل.

سوف تطفو الخلايا الصغيرة غير الناضجة ويجب أيضا التخلص منها. كرر هذا الغسيل خطوة ما مجموعه 10 مرات بعد الغسيل. انقل الصوارات إلى طبق تسعة سنتيمترات مع MBS زائد ps.

انقل الطبق إلى مجهر تشريح ومن الآن فصاعدا ، حافظ على الصيول عند 16 إلى 18 درجة مئوية قدر الإمكان. حدد نوعية جيدة من المرحلة السادسة باستخدام تصنيف Dumont باستخدام ماصة زجاجية ، واجمعها في طبق جديد مع MBS plus ps. يجب أن يكون للسيلات ذات النوعية الجيدة تصبغ متساو في نصف الكرة الأرضية الحيوانية وتظهر فصلا واضحا بين نصف الكرة الأرضية الحيوانية والنباتية.

يجب أن تكون جميعها من نفس الحجم تقريبا ، والتي يتراوح قطرها بين 1.2 و 1.4 ملم. اجمع حوالي اثنين إلى 300 cytes لكل حقنة ، مما يشكل حوالي 1000 cytes لكل تجربة. جودة موقع O هي مفتاح النجاح.

إذا أظهر Oside بعض التشوهات أثناء التحضير ، فإنني أوصيك بتصحيح مبيض من قطيع مختلف والبدء من جديد. استعدادا لحقن oligo antisense ، اضبط المكبس المعدني للحاقن الصغير على أدنى موضع له ، وأدخل شعيرات دموية زجاجية مملوءة بالزيت على المكبس المعدني. تحت مجهر التشريح ، قم بقص طرف الإبرة باستخدام مقص جراحي صغير.

اصنع نصيحة أصغر قدر الإمكان. الليزر التالي. شريط من الطفيلي على مرحلة المجهر وعليه توزيع ثلاثة ميكرولترات من محلول الحمض النووي بمعدل ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر.

مع هذا ، املأ طرف الإبرة. إذا تم احتجاز الهواء ، فيجب تكبير الفتحة. الآن ضع علامة مرئية على إبرة الحقن على بعد حوالي نصف ملليمتر من الحافة.

ثم تابع حقن الخلايا لحقن واحدة أولا ، وابحث عن منطقة خالية من خلايا البصيلات حيث يمكن للإبرة اختراق هذه المنطقة. أدخل الطرف على طول الحدود الاستوائية عن طريق التصويب على النقطة المركزية أسفل الحويصلة الجرثومة. في الوقت نفسه ، قم بتثبيت cyte باستخدام ملقط على الجانب الآخر.

الآن باستخدام التحكم في مفتاح القدم ، قم بإخراج المحلول ، وإخراج ما بين 4.6 و 9.2 نانوغرام من oligos antisense أو ما بين 250 بيكوغرام إلى 13.8 نانوجرام من الحمض النووي الريبي المرسال. بعد حقن جميع الصخورات ، انقلها إلى وسط الحضانة واتركها تحتضن بضعة أيام حتى يمكن إجراء التغييرات. في البروتيازوم.

في وقت لاحق ، انقل الصخورات بأقل قدر ممكن من الوسائط إلى أطباق مغلفة بستة سنتيمترات تحتوي على خمسة إلى ثمانية ملليلتر من وسط النضج. ثم دع الخلايا تتطور في هذه الوسائط لمدة 16 ساعة قبل حقنها بالحيوانات المنوية. لهذا البروتوكول ، يجب تحضير مخزون المنوية المجمد.

استشر البروتوكول النصي بعد 16 ساعة من الحضانة للنضج. انقل الصوارات بحذر شديد إلى طبق مغطى بالبيض بإجمالي ستة سنتيمترات مع MBS plus PS لغسلها. إذا تم إساءة التعامل مع cytes ، فقد يتم تنشيطها تلقائيا قبل ixy.

الآن ، عد الخلايا الناضجة وابحث عن بقع بيضاء تشير إلى أن الحويصلة الجرثومية للخلية قد تحللت. إذا كان أقل من 80٪ جيدا ، فإنهم بشكل جماعي ليسوا بصحة جيدة بما يكفي للبقاء على قيد الحياة في الإجراء ixy. للمتابعة.

املأ طبقا جديدا بوسط الحقن وانقل جميع الخلايا بدقة إلى الطبق بعد نصف ساعة. استمر في حقن الخلايا الناضجة بمحلول المنوية باستخدام نفس مستحضر الحاقن الموصوف للقليغوس. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون هناك منوي واحد أو اثنان لكل 4.6 نانولتر في محلول الحقن.

لاختبار محلول الحقن هذا ، قم بعمل قطرات من محلول DPI عند 0.3 ميكروغرام DPI لكل مليلتر وحقن 4.6 نانولتر في تلك القطرات. ثم احسب عدد المنوية في كل قطرة عن طريق المجهر الفلوري. بعد التأكد من تركيز المنوية ، قم بحقن الخلايا ب 4.6 نانو لتر من محلول المنوية.

تأكد من أن الوقت اللازم لحقن المحاليل يظل ثابتا وحقن البويضات بثبات مع الحد الأدنى من التوقف بين الحقن. بعد كل 100 حقنة تبادل ، محلول المنوية. بعد حقن جميع البويضات الناضجة ، يجب تحضين الطبق لمدة أربع إلى خمس ساعات ، ثم فحصه.

بالنسبة للأجنة التي خضعت للانقسام ، قد لا تكون أخاديد الانقسام واضحة مثل تلك الموجودة في الأجنة المخصبة الطبيعية التي تنقل جميع الأجنة المشقوقة إلى وسط الحضانة وتتركها تحتضن بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، يجب نقل الأجنة الباقية إلى التطور الجنيني 0.1 XMMR للأجنة ixy. تم فحص استخدام البويضات الناضجة في المختبر في تجارب جيدة ، حيث استجابت ما يقرب من 100٪ من بويضات الحويصلة الجرثومية للهروجسترون وأظهرت علامات النضج.

خضع حوالي 25٪ للانقسام. وصل 60 إلى 80٪ من الأجنة المشقوقة إلى مرحلة الانفجار ، ووصل حوالي ثلثها إلى مرحلة الشرغوف السباحة. كانت الأجنة ixy عبارة عن مزيج من الأجنة الطبيعية وغير الطبيعية التي تظهر أن حقن سوجو مضاد للمعنى في خلايا الوعاء الجرثومي ، متبوعا ب IVM و Dixie سمح بالتطور الجنيني المبكر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة بروتينات الأم قبل التحليل.