Name: التلاعب و في المختبر نضوج القيطم المورق البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: اكتشف طريقة حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولى في بويضات Xenopus laevis الناضجة مختبرياً لدراسة التطور الجنيني. تتيح هذه التقنية تثبيط البروتينات الأمومية أو فرط التعبير الجيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن ممتنون لأعضاء مختبر جوردون على المناقشة المفيدة. ك. هو زميل باحث في كلية وولفسون ويدعمه زمالة هيرشيل سميث لما بعد الدكتوراه ومؤسسة ساساكاوا البريطانية العظمى. يتم دعم مختبر Gurdon بمنح من Wellcome Trust (RG69899) و MRC إلى JBG.

<ol><li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyamoto%2C+K+%22Biology+and+Pathology+of+the+Oocyte%3A+Role+in+Fertility%2C+Medicine%2C+and+Nuclear+Reprogramming%22">Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming</a>. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).</li>
<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
<li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li>
<li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+antisense+oligonucleotides+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 75-81 (2010).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Wave1+is+required+for+reprogramming+transcription+in+oocytes+and+for+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development.</a> Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).</li>
<li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li>
<li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
<li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li>
<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

نحن هنا بالتفصيل طريقة جديدة لاستنزاف العوامل الأمهات أو بإفراط عن عوامل خارجية قبل الإخصاب. يتطلب هذا النظام اثنين من إبر دقيقة جدا، ولكن بدلا من ذلك يتخطى عملية جراحية من الضفادع، وتستخدم في طريقة نقل المضيف 7،17. فمن الأمثل لإزالة خطوة عملية جراحية ضفدع من حيث رعاية الحيوان. وعلاوة على ذلك، فإننا لا يجب أن تأخذ بعين الاعتبار لجودة الضفادع المضيف الأنثى لنقل التجارب، وهذا يعني أننا يمكن التخلص من عامل بيولوجي واحد أن يؤثر على نجاح التجارب. لذلك في هذا النظام نوعية البويضات التي تم الحصول عليها من الضفادع PMSG معبي هي عامل رئيسي البيولوجي التي هي مفتاح للتجارب الناجحة. نوعية البويضات يمكن الحكم بعد جمع defolliculation المبيض أو بعد. إذا لوحظ أي خلل في هذه المراحل، فمن الأمثل لجمع المبيض آخر من الضفادع جديد. نقطة أخرى عندما يمكنك التحقق من جودة البويضة هي بعد نضوج البويضة. إذا كانت أقل من 80٪ من progesteronتظهر البويضات المعالجة الإلكترونية علامات النضج، قد لا تكون قادرة على الحصول على عدد كاف من الأجنة لمزيد من التحليلات. استخدام defolliculation الأنزيمية بدلا من defolliculation اليدوي هو أيضا ميزة أخرى لاستخدام هذا النظام للحد من العمالة المطلوبة لdefolliculation. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الممكن أن defolliculation اليدوي قد يعطي تطور أفضل من العلاج الأنزيمية. كما هو مبين في الشكل (3)، ما يقرب من 10٪ من البويضات في المختبر نضجت يمكن أن تصل إلى مرحلة الشرغوف السباحة. يتم جمع هذه البيانات من 13 تجارب مستقلة بما في ذلك تلك التي أعلن عنها في 8 و التجارب الجديدة الحقن. يحتاج أسلوب نقل المضيف 75-150 البويضات في كل معاملة للحصول على بيانات ذات مغزى منذ 30-60٪ من البويضات نقل يمكن أن تصل إلى المرحلة العصيبة 17. أسلوبنا يبدأ عادة مع 200-300 البويضات في كل مجموعة التجريبية منذ ما يقرب من 40-60٪ من الأجنة المشقوق يمكن أن تصل إلىمرحلة استجابة العضلات. وتشير هذه البيانات إلى أن كلتا الطريقتين تدعم معدل التنموي معقول. لقد حصلنا حتى الآن 10 الضفادع على قيد الحياة من السيطرة حقن مرنا والسيطرة العقاقير البويضات حقن بنسبة ضئيلة باستخدام هذه التقنية، مشيرا إلى أن هذا النهج يدعم التنمية من خلال التحول. ويقدم لنا بويضة طريقة التلاعب-ICSI فرصة لاختبار دور العوامل الأمهات أثناء التطور الجنيني المبكر جدا، بعد وقت قصير من الإخصاب. وبالإضافة إلى ذلك، overexpression من العوامل الكروماتين المغيرة قبل الإخصاب قد تجعل من الممكن لإعادة الكروماتين الأم قبل الإخصاب لفهم الدول لونين الأمهات اللازمة لنمو. ويجوز لهذه الاستراتيجية أيضا تعمل بشكل جيد مع الحالية وتحرير الأنظمة الجينات مثل النسخ، مثل المنشط المستجيب نوكلياز (TALEN) 18،19 وكريسبر / CAS9 20،21 منذ يمكن التعبير عنها حتى قبل الإخصاب هذه. لذا، نهجنا الجديد لديه potentiالقاعدة لاستخدامها في العديد من التطبيقات في المستقبل.

القيطم المورق هو يستخدم على نطاق واسع، كائن نموذج قوي لدراسة تطوير 1. وذلك لأن البيض القيطم هي كبيرة بشكل غير عادي (حوالي 1،2-1،4 مم، بالمقارنة مع نظرائهم الثدييات يجري حوالي 0.1 مم) وفيرة. البيض يحتوي على توليفها أمهات وتخزينها المكونات، التي تكفي لدفع عجلة التنمية الجنينية حتى منتصف الأريمة الانتقالية (MBT، والتي تحدث في مرحلة 8-8.5 مع 4،000-8،000 خلايا). ويرافق MBT التي كتبها تفعيل الجينوم اقحي، التي تنتج ثم المنتجات الجينات الجنينية التي توجه مزيد من التطوير. العديد من الدراسات تهدف الى تحديد العوامل الأمهات هامة للتنمية. العديد من الدراسات تعتمد على حقن العقاقير [أليغنوكليوتيد (oligos) بما في ذلك أليغنوكليوتيد] morpholino إلى الأجنة المخصبة، والذي تدهور حالة البروتينات الأمهات يمكن ملاحظة في مرحلة المعيدة 2-4. بدلا من ذلك، يتم حقن من mRNAs لم المخصبةbryos يزعج وظائف الجينات أو لتتبع مصائر البروتينات overexpressed. ومع ذلك، فإن الحقن في الأجنة مرحلة خلية واحدة عادة لا يؤثر على مستويات التعبير من البروتينات الأمهات في المراحل الجنينية المبكرة جدا قبل MBT. أنشئت Heasman وايلي طريقة نقل المضيف للتغلب على هذه المسألة 5. في طريقتهم، يتم حقن البويضات defolliculated يدويا مع oligos العقاقير ونقلها إلى الإناث المضيف 6. وdownregulated البروتينات قبل الإخصاب بحيث الأدوار من البروتينات downregulated في التطور الجنيني المبكر يمكن فحصها. أدت هذه الطريقة استنزاف الأمهات إلى التعرف على العديد من الأدوار التنموية الفريدة من البروتينات الأمهات، كما استعرضت في 7. في هذا التقرير، إلا أننا التفاصيل أسلوبنا وضعت مؤخرا، والذي يتحقق استنزاف الأمهات أو overexpression من مرنا قبل الإخصاب دون defolliculation اليدوي ونقل المضيف8. يتطلب دليل defolliculation الكثير من الوقت ونقل المضيف كثيرا ما يحتاج تقنيات ماهرا وترخيص محدد لجراحة الحيوان، مما يعوق كثرة استخدام أسلوب استنزاف الأمهات. يتم استبدال Defolliculation ونقل المضيف عن طريق defolliculation الأنزيمية 9،10 وداخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية (الحقن المجهري) 11-13 على التوالي. الحقن المجهري للبيض كانت في الأصل تستخدم لإنتاج الضفادع المعدلة وراثيا 12. وقد تم زرع الحيوانات المنوية والأجنة نوى أيضا إلى البويضات في المختبر البرمائيات نضجت 11،14،15. هنا، وتبين لنا طريقة لدينا خطوة بخطوة لحقن الحيوانات المنوية في المختبر لالبويضات الناضجة التي كانت قبل حقن مع oligos العقاقير أو مرنا.

<table><tbody><tr><td>مصل الفرس الحوامل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) &nbsp;</td><td>MSD Animal Health</td><td>VM 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu مسحوق ومذيب لمحلول الحقن</td></tr><tr><td>ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات (MS222)</td> <td>Sigma</td><td>A5040</td><td>للتخدير</td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>لإزالة البويضات. يخزن في -20&nbsp; &# 176 ؛ ج.</td></tr><tr>شركة <td>دروموند نانوجيكت</td><td>دروموند العلمية</td><td>3-000-205 / 206</td><td>للحقن المجهري</td></tr><tr><td>الزجاجي الشعري &nbsp ؛</td><td>مختبرات ألفا</td><td>7 " Drummond # 3-000-203-G / XL</td><td></td></tr><tr><td>لمجتذب الماصات الدقيقة للحقن المجهر&nbsp;</td><td>SUTTER Instrument</td><td>Model D-97</td><td>للحقن المجهري</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>ل in vitro النضج و ICSI</td></tr><tr><td>14 مل أنبوب الطرد المركزي فائق الوضوح &nbsp ؛</td><td>بيكمان كولتر المملكة المتحدة المحدودة</td><td>344060</td><td>لتنقية المنوية</td></tr><tr><td>OptiPrep كثافة التدرج المتوسطة (اليودكسانول)</td> <td>سيجما</td><td>D1556</td><td>لتنقية المنوية</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>كاشف نفاذية الخلية</td></tr><tr><td>شاكر</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>لإزالة البويضات</td></tr><tr><td>مجهر تشريح (مجهر تكبير ستيريو) ZEISS</td><td></td> <td>Semi SV6</td><td>لجمع البويضات والحقن المجهري</td></tr><tr><td>50 & mu ؛ مرشح المسام م</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>لتنقية المنوية</td></tr><tr><td>جهاز طرد مركزي</td><td>فائق Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>لتنقية المنوية</td></tr><tr><td>أنبوب طرد مركزي 50 مل</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 أو 210261</td><td>جمع البويضات وتفاعل نزع الفينيل</td></tr><tr><td>15 مل أنبوب الطرد المركزي</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>لتنقية المنوية</td></tr><tr><td>90 مم بتري طبق&nbsp;</td>طبق ثقافة الخلية <td>Thermo Scientific</td><td>101VR20 / C</td><td></td></tr><tr><td>سهل الإمساك ، 60 & nbsp ؛ x&nbsp; طبق</td> ثقافة الخلية <td>سهل الإمساك 353004</td><td></td>15 مم <td>FALCON</td></tr><tr><td>، 35 & nbsp ؛ x&nbsp; 15 مم</td><td>351008</td><td></td> <td>فالكون</td></tr></tbody></table>

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

تم استخدام بيض البرمائيات على نطاق واسع لدراسة التطور الجنيني. التطور الجنيني المبكر مدفوع بالعوامل المخزنة من قبل الأم المتراكمة أثناء تكوين البويضات. من أجل دراسة أدوار هذه العوامل الأمومية في التطور الجنيني المبكر ، من المستحسن التلاعب بوظائفها منذ بداية التطور الجنيني. يتم تحقيق الطرق التقليدية للتداخل الجيني عن طريق حقن قليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى (oligos) أو mRNA في البويضات المخصبة ، مما يتيح التعبير الناقص أو المفرط عن بروتينات معينة ، على التوالي. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطرق عادة أكثر من عدة ساعات حتى يتأثر التعبير عن البروتين ، وبالتالي ، فإن تداخل وظائف الجينات غير فعال خلال المراحل الجنينية المبكرة. هنا ، نقدم نظاما تجريبيا يمكن من خلاله تغيير مستويات التعبير عن بروتينات الأم قبل الإخصاب. يتم نزع فتيل بويضات Xenopus laevis التي يتم الحصول عليها من المبايض عن طريق الحضانة بالإنزيمات. يتم حقن oligos antisense أو mRNAs في البويضات غير المعطلة في مرحلة الحويصلة الجرثومية (GV). تنضج هذه البويضات في المختبر إلى البويضات في مرحلة الطور الثاني (MII) ، تليها حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI). بهذه الطريقة ، يمكن أن يصل ما يصل إلى 10٪ من أجنة الحقن المجهري تصل إلى مرحلة الشرغوف السباحة ، مما يسمح بإجراء اختبارات وظيفية لضربة قاضية جينية معينة أو الإفراط في التعبير. يمكن أن يكون هذا النهج طريقة مفيدة لدراسة أدوار العوامل المخزنة من قبل الأم في التطور الجنيني المبكر.

تم فحص التطور الجنيني للأجنة باستخدام الحقن المجهري في المختبر نضجت البويضات (الشكل 3A). معدلات نضوج البويضات GV إلى مرحلة صناعة المعلومات هي متغيرة وتعتمد إلى حد كبير على نوعية البويضة. في تجارب جيدة، ما يقرب من 100٪ من البويضات GV الاستجابة لهرمون البروجسترون، وتظهر علامات نضوج البويضة، ليصبح البيض أخيرا في مرحلة صناعة المعلومات. وتعرض جميع البويضات نضجت إلى الحقن المجهري وحوالي 25٪ من البيض حقن المشقوق (الشكل 3A، ن = 13 من أجل السيطرة سارعت البويضات حقن بنسبة ضئيلة و n = 7 لا لحقن البويضات بنسبة ضئيلة). ما يقرب من 60٪ أو 80٪ من الأجنة المشقوق، التي تنتج من السيطرة البويضات حقن بنسبة ضئيلة أو غير حقن بويضة، على التوالي، وصل إلى مرحلة الأريمة / المعيدة. بين أجنة الأريمة / المعيدة، كان ما يقرب من نصف الأجنة في عينات حقن بنسبة ضئيلة من نوعية جيدة (تقريبا أي علامات على الانقسام الشاذ وموت الخلايا المبرمج) في حين كانت 82٪ من الأجنة الأريمة / المعيدة ذات نوعية جيدة في نعينات حقنه في (الشكل 3A). وأخيرا، وصلت 41٪ و 11٪ من الأجنة المشقوق في عينات حقن بنسبة ضئيلة استجابة العضلات والمراحل الشرغوف السباحة، على التوالي، في حين أن 60٪ و 29٪ من الأجنة المشقوق في عينات غير حقن فعلت (الشكل 3A). هذه الأجنة ICSI هي خليط من الأجنة العادية وغير العادية (الشكل 3B). بعض منهم الخضوع التحول وتطوير لتنضج الضفادع 8. وتشير هذه النتائج إلى أن حقن العقاقير [أليغنوكليوتيد إلى البويضات GV، تليها IVM والحقن المجهري، ويسمح كفاءة التطور الجنيني المبكر. على الرغم من أن حقن oligos العقاقير نفسه يقلل التطور الجنيني، فإننا لا نزال قادرين على الحصول على ما يكفي من الأجنة لأغراض عديدة التجريبية مثل فحص معدلات النمو، RT-PCR، وصمة عار الغربية وهلم جرا. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> تين<html> لدى عودتهم 1: الأمثلة النموذجية لالقيطم المورق البويضات ذات نوعية جيدة أو سيئة النوعية لفي التجارب المختبرية النضج. (A) مثال على البويضات نوعية سيئة. على سبيل المثال، لا يتم استخدام البويضات يظهر تصبغ غير مكتمل لتجارب لاحقة. كل القيطم المورق البويضة حوالي 1،2-1،4 ملم في القطر. (ب) بويضة defolliculated جزئيا. وتغطي النصف الأيمن من بويضة من قبل خلايا بصيلات، والتي يمكن تمييزها من خلال وجود الأوعية الدموية. سهم يبين منطقة خالية من خلايا بصيلات وحيث يتم حقن إبرة الحقن. (C) مثال من البويضات ذات نوعية جيدة، والتي هي متساوية الحجم وتظهر نصفي الكرة الأرضية الحيوان المصطبغة بالتساوي مع تباين واضح بين نصف الكرة الحيوانية والنباتية في نصف الكرة الأرضية. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 2: القيطم المورق البويضات قبل وبعد النضج بعد نضوج البويضة، تظهر بقع بيضاء واضحة في الجزء العلوي من نصفي الكرة الأرضية الحيوانية وخلايا بصيلات ومقشر قبالة. كل بويضة القيطم المورق حوالي 1 ملم في القطر. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> الشكل 3: تطوير الأجنة ICSI، التي تنتج من البويضات في المختبر نضجت. تتلخص (A) وضع الأجنة ICSI إلى كل مرحلة. تم حقن البويضات مع التحكم سارعت أليغنوكليوتيد] العقاقير (مراقبة حقن بنسبة ضئيلة) أو بدون حقن (غير حقن)، تليها IVM والحقن المجهري. يظهر رقم المقابلة من الأجنة في كل مرحلة فوق القضبان. يعني هو مبين ± SEM. N = 4-13 تجارب مستقلة / و مختلفةemales. (ب) أمثلة على قيد الحياة الأجنة ICSI. تم إنتاج هذه الأجنة مرحلة tailbud في تجربة واحدة، التي استخدمت فيها حوالي 200 البويضات كمادة البداية.

نصف طرق التلاعب بالبويضات غير الناضجة Xenopus laevis ، والنضج المختبري للبويضات إلى البويضات ، وحقن المنوية داخل الهيولى. يسمح هذا البروتوكول بتدهور بعض بروتينات الأم والإفراط في التعبير عن الجينات ذات الأهمية عند الإخصاب ، وبالتالي فهو ذو قيمة لدراسة أدوار عوامل محددة في التطور الجنيني المبكر.

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

تهدف التجربة التالية إلى تثبيط البروتينات الأمية المخزنة في الخلايا البيضية أو الإفراط في تعبير بروتينات معينة عند نقطة إخصاب بيوض الضفادع. ويتم تحقيق ذلك عن طريق حقن أوليغونوكليوتيدات مضادة للمعنى أو mRNA في خلايا بيضية غير ناضجة تم إزالة تنظيمها إنزيمياً، وذلك لتفكيك بروتين معين أو الإفراط في تعبيره. وكخطوة ثانية، تُنقل الخلايا البيضية إلى وسط يحتوي على البروجسترون، مما يحفز نضج الخلايا البيضية لتتحول إلى بيوض.بعد ذلك، يتم حقن الحيوانات المنوية في البويضات التي نضجت في المختبر لمراقبة تأثير تثبيط التعبير الجيني أو فرط تعبيره على التطور الجنيني. وفي نهاية المطاف، يعد تطور البويضات المحقونة بالـ oligonucleotides إلى شرانق سابحة بمثابة الاختبار الوظيفي لتثبيط التعبير الجيني أو فرط تعبيره. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالوسائل الحالية مثل النقل إلى مضيف، في إمكانية تجاوز عملية جراحة الضفدع باستخدام البروتوكولات القياسية.اجمع عينة من الـ SAC تحتوي على خلايا سليمة في طبق بتري بقطر تسعة سنتيمتر يحتوي على MBS بالإضافة إلى ps. بعد ذلك، قم بتفكيك المبيض إلى قطع مربعة يتراوح عرضها بين واحد إلى اثنين سنتيمتر. اجمع حوالي خمسة ملليلتر من المبيض الممزق مع الخلايا في أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر.بعد ذلك، اشطف الأنسجة بمحلول MBS plus PS عدة مرات، واجمع البويضات في 15 milliliters من محلول MBS plus ps الطازج. الآن، أضف سبع وحدات من إنزيم إزالة الغشاء الخلوي إلى المعلق، وحضن المعلق مع تحريك خفيف حتى يتم إزالة الغشاء الخلوي جزئياً على الأقل. ستستغرق هذه العملية ساعة واحدة على الأقل بعد التحضين.املأ الأنبوب بمحلول MBS مضافاً إليه Ps لإيقاف التفاعل. اسحب المحلول نحو جدار الأنبوب وليس مباشرة فوق الخلايا. اترك الأنسجة تترسب ثم تخلص من السائل والعامل.ستطفو الخلايا الصغيرة غير الناضجة، ويجب التخلص منها أيضاً. كرر خطوة الغسل هذه إجمالي 10 مرات بعد عمليات الغسل. انقل الخلايا إلى طبق بقطر تسعة سنتيمتر يحتوي على MBS plus ps.انقل الطبق إلى مجهر تشريحي، ومن هذه الخطوة فصاعداً، حافظ على الخلايا عند درجة حرارة 16 إلى 18 درجة Celsius قدر الإمكان. اختر خلايا من المرحلة السادسة (Stage six) ذات جودة عالية باستخدام تصنيف Dumont، وباستخدام ماصة زجاجية، اجمعها في طبق جديد يحتوي على MBS plus ps. يجب أن تتميز الخلية عالية الجودة بصبغة متساوية في نصف الكرة الحيواني، وأن تظهر انفصالاً واضحاً بين نصفي الكرة الحيواني والنباتي.كما يجب أن تكون جميعها ذات حجم متقارب، بحيث يتراوح قطرها بين 1.2 و1.4 millimeters. اجمع ما يتراوح بين 2 إلى 300 cytes لكل حقنة، ليصل المجموع إلى حوالي 1000 cytes لكل تجربة. وتعد جودة موقع O مفتاحاً لتحقيق النجاح.إذا ظهر أي خلل في المبيض أثناء التحضير، فأنا أوصي بجمع مبيض من قطيع مختلف والبدء من جديد. استعداداً لحقن الأوليغونوكليوتيد المضاد للمعنى، اضبط المكبس المعدني للمحقن الدقيق على أدنى وضعية له، ثم أدخل أنبوباً شعرياً زجاجياً مملوءاً بالزيت فوق المكبس المعدني. وباستخدام مجهر تشريحي، قم بقص طرف الإبرة باستخدام مقص جراحي صغير.اجعل الطرف دقيقاً قدر الإمكان. بعد ذلك، ضع شريطاً من البارافورم على منصة المجهر، ثم وزع فوقه 3 µL من محلول الحمض النووي بتركيز 1 µg/µL.باستخدام ذلك، املأ طرف الإبرة. وفي حال انحباس الهواء، يجب توسيع الفتحة. الآن، ضع علامة مرئية على إبرة الحقن على بُعد حوالي 0.5 mm من الطرف.بعد ذلك، ابدأ بحقن الخلايا، حيث يتم حقن خلية واحدة أولاً؛ ابحث عن منطقة خالية من الخلايا الجريبية يمكن للإبرة اختراقها في هذه المنطقة. أدخل طرف الإبرة على طول الحدود الاستوائية من خلال التصويب نحو النقطة المركزية أسفل الحويصلة الجرثومية. وفي الوقت ذاته، قم بتثبيت الخلية باستخدام ملقط من الجانب المقابل.الآن، وباستخدام مفتاح التحكم بالقدم، قم بطرد المحلول، ثم اطرد ما بين 4.6 و 9.2 nanograms من oligonucleotides مضادة للمعنى أو ما بين 250 picograms إلى 13.8 nanograms من messenger RNA. بعد حقن جميع الخلايا، انقلها إلى وسط تحضين واتركها تحضن لبضعة أيام حتى تحدث التغييرات في proteasome.لاحقاً، انقل الخلايا مع أقل كمية ممكنة من الوسط الغذائي إلى أطباق agros مغلفة بقطر ستة سنتيمترات تحتوي على 5 إلى 8 ملليلتر من وسط الإنضاج. ثم اترك الخلايا لتنمو في هذا الوسط لمدة 16 ساعة قبل حقنها بالحيوانات المنوية. بالنسبة لهذا البروتوكول، يجب تحضير مخزون من الحيوانات المنوية المجمدة.راجع بروتوكول النص بعد 16 ساعة من الحضانة للنضج. انقل الخلايا بحذر شديد إلى طبق مكسو بـ egg gross بقطر ستة سنتيمتر يحتوي على MBS plus PS لغسلها. إذا تم التعامل مع الخلايا بشكل غير صحيح، فقد تنشط تلقائياً قبل الـ ixy.الآن، قم بعدّ الخلايا الناضجة وابحث عن البقع البيضاء التي تشير إلى تحلل الحويصلة الجرثومية للخلية. إذا كانت نسبة الخلايا السليمة أقل من 80%، فإنها مجتمعة لا تتمتع بصحة كافية للبقاء على قيد الحياة أثناء إجراء ixy. للمتابعة.املأ طبقاً جديداً بوسط الحقن وانقل جميع الخلايا بدقة إلى الطبق بعد نصف ساعة. ابدأ بحقن الخلايا الناضجة بمحلول الحيوانات المنوية باستخدام نفس تحضير المحقن الموصوف لـ oligos. من الناحية المثالية، يجب أن يكون هناك حيوان منوي واحد أو اثنان لكل 4.6 nanoliters في محلول الحقن.لاختبار محلول الحقن هذا، قم بإعداد قطرات من محلول DPI بتركيز 0.3 micrograms DPI لكل milliliter، ثم احقن 4.6 nanoliters في هذه القطرات. بعد ذلك، قم بعدد الحيوانات المنوية في كل قطرة باستخدام المجهر الفلوري. وبعد التأكد من تركيز الحيوانات المنوية، احقن الخلايا بـ 4.6 nanoliters من محلول الحيوانات المنوية.تأكد من بقاء الوقت المطلوب لحقن المحاليل ثابتاً، واحقن البويضات بشكل مستمر مع تقليل التوقفات بين عمليات الحقن قدر الإمكان. استبدل محلول الحيوانات المنوية بعد كل 100 عملية حقن. وبعد الانتهاء من حقن جميع البويضات الناضجة، يجب تحضين الطبق لمدة تتراوح من أربع إلى خمس ساعات، ثم فحصه.بالنسبة للأجنة التي خضعت للانقسام، قد لا تكون أخاديد الانقسام واضحة مثل تلك الموجودة في الأجنة المخصبة الطبيعية؛ لذا يتم نقل جميع الأجنة المنقسمة إلى أوساط الحضانة وتُترك لتحضن طوال الليل. وفي اليوم التالي، يجب نقل الأجنة الباقية إلى 0.1 XMMR لتطوير أجنة ixy. وقد تم فحص استخدام البويضات الناضجة في المختبر في تجارب جيدة، حيث استجابت ما يقرب من 100% من البويضات في مرحلة الحويصلة الجرثومية للبروجسترون وأظهرت علامات النضج.خضع حوالي 25% من الأجنة لعملية الانقسام. ووصل 60 إلى 80% من الأجنة المنقسمة إلى مرحلة البلاستوجاست، ووصل حوالي ثلث هذه الأجنة إلى مرحلة الشرغوف السابح. وكانت أجنة ixy مزيجاً من أجنة طبيعية وأخرى غير طبيعية، مما يشير إلى أن حقن sogo المضاد للمعنى في الخلايا الجرثومية، متبوعاً بـ IVM وDixie، قد سمح بالتطور الجنيني المبكر.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع البروتينات الأمومية قبل عملية التحليل (factorization).

manipulation-vitro-maturation-xenopus-laevis-oocytes-followed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

هنا علينا أن نظهر للحشوية...

Microinjection من البويضات المورق القيطم

تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

القيطم ظهائر الجنينية هي نموذج مثالي لنظام دراسة سلوكيات الخلية مثل التنمية وتغير شكل القطبية خلال التشكل الظهارة. ويتزايد الأنسجة التقليدية لعينات محددة يجري استكمالها التصوير الخلية الحية مبائر. هنا نظهر طرق لعزل الأنسجة الضفادع وتصور الخلايا الظهارية العيش والهيكل الخلوي وذلك باستخدام الخلايا الحية المجهري متحد البؤر.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

نحن التقرير هنا التعبير القوي والفعال للالبروتينات الفلورية بعد حقن مرنا في البويضات غير المخصبة من السهيم. فإن تطوير تقنية حقن مكروي في هذا حبلي القاعدية يمهد الطريق لبعيدة المدى الابتكارات التقنية في هذا النظام النموذجي الناشئة، بما في ذلك في مجال التصوير فيفو والتلاعب الجينات المحددة.

التعبير عن البروتينات الفلورية في السهيم من جانب مرنا حقن البويضات غير المخصبة في

مخطوطة يوفر هنا مجموعة بسيطة من طرق لتحليل إفراز ونشر بروابط الموسومة fluorescently في القيطم. ويوفر هذا السياق لاختبار قدرة بروتينات أخرى لتعديل توزيع يجند والسماح التجارب التي قد تعطي نظرة ثاقبة آليات تنظيم التدرجات محدثة التخلق.

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

في أجنة Xenopus ، تكون الخلايا من سقف الأريمية متعددة القدرات ويمكن برمجتها لتوليد أنسجة مختلفة. هنا ، نصف بروتوكولات استخدام مصانع سقف الأريمة البرمائية كنظام فحص للتحقيق في الميزات الرئيسية في الجسم الحي وفي المختبر للتطور العصبي المبكر.

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

نصف بويضة Xenopus ونظام غطاء حيواني للتعبير عن استنساخ الجينات القادرة على إحداث استجابة في الأديم الظاهر المختص ، ونناقش تقنيات التحليل اللاحق لهذه الجينات. هذا النظام مفيد في التحديد الوظيفي لمجموعة واسعة من المنتجات الجينية.

الاستنساخ وظيفية باستخدام<em&gt; القيطم</em&gt; نظام التعبير البويضة

ويرد بروتوكول الأمثل لنضوج البويضات في المختبر من الزرد تستخدم للتلاعب من المنتجات الجينات الأمهات هنا.

التلاعب وظيفي من الأم جين المنتجات التي تستخدم<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج البويضة في الزرد

يوضح هذا البروتوكول طريقة القائم على مضان لتصور الأوعية الدموية وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . الأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد دقائق من حقن صبغة الفلورسنت في قلب الضرب من الجنين بعد التلاعب الجيني و / أو الدوائية لدراسة التنمية القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي .

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

نحن نصف طريقة تضييق فيزيائي لتكوين أجنة صغيرة من أجنة Xenopus laevis أحادية الخلية.

التلاعب الجسدي لتوليد أجنة زينوبوس الصغيرة

يصف هذا البروتوكول إجراءات النضج المختبري لبويضات الفئران، والتلقيح الصناعي ، والزراعة الجنينية اللاحقة حتى مرحلة الكيسة الأريمية.

نضج بويضات الفأر في المختبر، والتخصيب، وزراعة الأجنة قبل الانغراس

اكتشف طريقة حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولى في بويضات Xenopus laevis الناضجة مختبرياً لدراسة التطور الجنيني. تتيح هذه التقنية تثبيط البروتينات الأمومية أو فرط التعبير الجيني.

التلاعب و

استكشف المزيد من الفيديوهات