تحديد غشاء طوبولوجيا البروتين عن طريق الإسفار البروتياز الحماية (FPP)

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد طوبولوجيا بروتينات الغشاء المتكاملة. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعبير عن الانصباب والبروتين بين البروتين الفلوري الأخضر أو GFP وذيول الأمينية أو الكربوكسيل للغشاء. بروتين محل اهتمام الخلايا لأغراض التحكم ، يمكن التعبير عن البروتينات الفلورية القابلة للذوبان مثل RFP.

بعد ذلك ، يخضع غشاء البلازما للنفاذية الانتقاائية. باستخدام حفر المنظفات ، ستخرج بروتينات الفلورسنت القابلة للذوبان من الخلية ، بينما سيتم الاحتفاظ ببروتينات الفلورسنت المرتبطة بالغشاء داخل الخلية. الخطوة الأخيرة هي تطبيق البروتياز على خلايا البيرم وتحديد الاحتفاظ بإشارة الفلورسنت أو فقدانها.

في النهاية ، يتم استخدام التغييرات في شدة التألق التي لوحظت باستخدام التصوير المجهري الفلوري لإظهار طوبولوجيا واتجاه بروتينات الغشاء المتكاملة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل رسم خرائط الحاتمة ، هي أن الإجراء لا يتطلب الكثير من المعدات المتخصصة أو الكواشف المختلفة التي قد يصعب الحصول عليها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا بروتين الغشاء ، مثل مجالات بروتين الغشاء المتكامل التي قد تكون موجودة داخل العصارة الخلوية مقابل المجالات التي قد تكون موجودة داخل تجويف العضيات مثل الشبكة الإندوبلازمية الذهب G أو الجسيمات الداخلية.

ابدأ هذا الإجراء بتوليد البروتين الفلوري KY والتحقق من صحته كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم قم بنقل البروتين الفلوري KY إلى خلايا الكلى الجنينية البشرية أو خلايا HEK 2 93 باستخدام أي طريقة تعداء قياسية عالية الكفاءة ومنخفضة السمية ، بما في ذلك التقنيات القائمة على الدهون أو الفيروسية أو التثقيب الكهربائي لتوليد تعبير عابر أو مستقر ، ثم يتم طلاء الخلايا على زلات غطاء مطلية بالبولي لايسين. الحفاظ على الخلايا لمدة خمس إلى 48 ساعة في وسط زراعة الأنسجة المناسبة في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة القادرة على ثاني أكسيد الكربون.

راقب الخلايا للتعبير عن بروتين اندماج GFP باستخدام الفحص المجهري الفلوري epi ، وعادة ما تصل إشارة الفلورسنت الجوهرية لإشارة الفلورسنت GFP إلى الحد الأقصى في غضون 24 إلى 72 ساعة. بعد التعدي. يمكن أيضا مراقبة استخدام الخلايا عندما تصل إشارة الفلورسنت إلى أقصى مستوى من التعبير عن البروتين عن طريق تحليل اللطخة المناعية باستخدام الأجسام المضادة الموجهة إما ضد البروتين محل الاهتمام أو جزء GFP.

للبدء في إعداد نظام التروية الذي تغذيه بالجاذبية لعلاج الخلايا. قم بإعداد محاقن سعة 50 مليلتر للمحاليل ذات أنابيب البولي إيثيلين المتصلة بخزانات مستقلة وبمجمع بمخرج واحد في الحمام. ضع ماصة الشفط للحفاظ على حجم حمام ثابت وتحقيق تبادل المحلول عن طريق التبديل يدويا بين خزانات التروية لاختراق غشاء البلازما.

أولا ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من الخلايا. اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منها. في المخزن المؤقت KHM ، ضع زلات الغطاء على مرحلة المجهر الفلوري واجمع الصورة الأولى ، والتي تمثل صورة التحكم غير المنفذة لاختراق غشاء البلازما بشكل انتقائي.

أضف رقما في المخزن المؤقت KHM إلى الخلايا ، وقم بدمج الخلايا بمخزن مؤقت بالإضافة إلى رقم بمعدل خمسة ملليلتر في الدقيقة لمدة 10 إلى 60 ثانية. يتم إجراء تأكيد أن غشاء البلازما يتأرى بشكل كاف بسهولة عن طريق التعبير عن جزيء GFP أو RFP قابل للذوبان ، والذي سينتشر بسهولة خارج الخلية التي تلي الغشاء. يؤكد الاختراق بعد ذلك أن وهم بروتين GFP ذي الأهمية هو غشاء متكامل من خلال تأكيد الاحتفاظ الخلوي بإشارة الفلورسنت بعد الحفر واختراق غشاء البلازما.

بعد ذلك ، عبر عن بروتين فلوري عضوي محدد مثل بروتين الميتوكوندريا كما هو مشار إليه في بروتوكول النص. تحديد ظروف التعبير المثلى كما كان من قبل. تأكد من أن الحفر والتركيز مناسبان لنوع الخلية المستخدم من خلال التأكد من أن مورفولوجيا قنوات الأعضاء داخل الخلايا تظل ثابتة على مدى التعرض لفترات طويلة.

لحفر toin. بعد غسل الخلايا في المخزن المؤقت KHM ، أضف البروتياز مباشرة على الخلايا. اطلع على الخلايا بمعدل تدفق خمسة ملليلتر في الدقيقة ، باستخدام نظام التروية الذي يتغذى بالجاذبية لاستحمام المستحضر باستمرار.

بعد ذلك ، حدد ما إذا كانت إشارة الفلورسنت مستمرة أو تتحلل. اجمع صور الفحص المجهري الفلوري تحت مجموعات المرشحات المناسبة باستخدام وظيفة التقاط صورة الفيديو على مجهر الفلورسنت الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر. تحديد كثافة إشارة الفلورسنت كدالة لحالة الحضانة.

احصل على متوسط شدة البكسل داخل منطقة الاهتمام التي تحيط بخلية فردية. يتوافق فقدان أكثر من 90٪ من شدة الإشارة الأولية على مدى 30 إلى 60 ثانية مع التحلل المحلل للبروتين GFP ky. يجب أن يحدث اختفاء كامل لإشارة الفلورسنت القابلة للذوبان في غضون 10 إلى 60 ثانية من تطبيق الأرقام toin.

يتم تحقيق تأكيد أن البروتين محل الاهتمام مرتبط بالعضيات داخل الخلايا من خلال ملاحظة الاحتفاظ بإشارة الفلورسنت بعد الديجون والنفاذ. تم دمج ذيل الكربوكسيل لكيناز الغشاء LTK two مع GFP وتم التعبير عنه بشكل عابر الفلورية LTK. تم فقد إشارتين GFP بسرعة بعد إضافة البروتيناز K مما يشير إلى موقع نهاية الكربوكسيل ل ltk two داخل العصارة الخلوية.

Cavi و GFP هو بروتين غشاء بلازما مع جزء GFP متصل بمجال العصارة الخلوية. كما هو الحال مع LTK two ، فإن الإشارة من cavi و GFP هي أرقام toin غير حساسة ، ولكنها حساسة للإضافة اللاحقة للبروتياز DS الأحمر mito يشفر البروتين الفلوري الأحمر المدمجة في تسلسل استهداف الميتوكوندريا من السيتوكروم C أوكسيديز بعد تغلغل الديجون ، بالإضافة إلى إضافة البروتيناز K. يظل التألق المرتبط ب DS الأحمر mito مستقرا. هذا يتوافق مع وجود الفلور أربعة في الميتوكوندريا حيث لا يتعرض للعصارة الخلوية.

عندما يكون الجزء الفلوري المتصل ببروتين الغشاء مواجها للجزء الخارجي من الخلية ، كما هو الحال في بروتين البريون المثبت على GPI المرتبط ببروتين الفلورسنت الأصفر. يجب أن تعمل معالجة البروتيناز على إخماد إشارة الفلورسنت بسرعة دون الحاجة المسبقة إلى تغلغل عفريت الحفر كما هو متوقع. بعد معالجة البروتيناز ، اختفت إشارة الفلورسنت خارج الخلية بسرعة للخلايا التي تعبر عن هذا البناء.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ساعة إلى ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أكبر لكيفية تحديد طوبولوجيا بروتين الغشاء الذي يثير اهتمامك.