عزل الحمض النووي الريبي من خلية مجموعات سكانية فرعية محددة عن طريق الليزر والتقاط تسليخ مجهري جنبا إلى جنب مع رابيد Immunolabeling

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية إجراء وسم مناعي سريع لمجموعة من خلايا دماغ الفأر المعزولة عن طريق التشريح المجهري بالالتقاط الليزري (LCM)، مع الحفاظ على سلامة الـ RNA في العينات. ويتم تحقيق ذلك من خلال تجميد أنسجة الدماغ التي تم تشريحها بسرعة في البداية، ثم يتم قطع الدماغ إلى مقاطع رقيقة على شرائح مجهرية زجاجية خالية من الـ RNA ومعالجتها بصبغ مناعي سريع.

أخيرًا، يتم عزل مجموعة الخلايا المستهدفة باستخدام تقنية LCM. وفي نهاية المطاف، تتيح عملية الصبغ السريع المتبوعة بالتشريح المجهري بالتقاط الليزر تحديد التغيرات في تعبير الجين المستهدف في عينة الخلايا التجريبية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل فرز الخلايا المنشط فلورياً، في الحفاظ على الدقة المكانية، مما يسمح بعزل خلية ES محددة من النسيج المحيط بها.

بشكل عام، يواجه الأشخاص الجدد في استخدام خلية سميث هذه صعوبات لأن هذا الإجراء يتضمن عدة خطوات حرجة تتطلب العمل بسرعة للحفاظ على سلامة الـ RNA في العينات. ولتحضير العينات للتقطيع، يتم تشريح الأدمغة من فئران في اليوم الأول بعد الولادة في وسط L 15 مبرد بالثلج خلال دقيقتين من التضحية. بعد ذلك، توضع الأدمغة في قوالب التضمين بالوضعية المناسبة للتقطيع، وتُملأ القوالب بوسط تضمين الأنسجة المجمدة.

بعد ذلك، قم بتجميد العينات فوراً في النيتروجين السائل واحفظها عند درجة حرارة 80- درجة مئوية خلال 30 ثانية من التجميد السريع. الآن، قم بمعالجة الشرائح الزجاجية المغلفة بالغشاء بعملية إزالة تلوث RNA السطحي لإزالة أي كميات ضئيلة من RNA. اشطفها بماء DEPC واتركها تجف في الهواء بمجرد أن تصبح الشرائح جافة.

اضبط درجة حرارة غرفة الميكروتوم المجمد (cryostat) على 20- درجة Celsius وانقل العينة المجمدة إلى الجهاز. لكل عينة، قم بتثبيت الكتلة المجمدة على مشبك العينات وقطع العينات بسمك 10 micron، مع تجميع المقاطع على شرائح مغطاة بغشاء. بعد ترك المقاطع لتجف لمدة 10 دقائق على الأقل، استخدم قلم حاجز كاره للماء لإحاطة الأنسجة.

بعد حوالي 10 ثوانٍ، ضع الشرائح في محلول تثبيت بارد مُحضّر حديثاً لمدة لا تزيد عن خمس دقائق عند درجة حرارة -20 °C. والآن، انقل الشرائح إلى صينية نظيفة معالجة مسبقاً بمحلول إزالة تلوث RNA السطحي. أولاً، رجّ الشرائح مرة واحدة لإزالة أي محلول تثبيت زائد، واغسلها من خلال غمسها سريعاً من ست إلى ثماني مرات في D-E-P-C-P-B-S، ثم نفض الشرائح.

لإزالة فائض محلول D-E-P-C-P-B-S، أضف 200 µL من محلول الجسم المضاد الأولي إلى كل مقطع. وبعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، اغسل الشرائح بغمرها ثلاث مرات سريعاً في محلول D-E-P-C-P-B-S ثم هزها مرة واحدة لإزالة فائض محلول الغسيل. بعد ذلك، يتم تحضين العينات في 200 µL من محلول الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ست دقائق.

اغسل الشرائح في D-E-P-C-P-B-S كما تم توضيحه للتو، ثم حضنها في محلول BC مُحضّر حديثاً لمدة أربع دقائق بعد غسلة سريعة أخرى بـ D-E-P-C-P-B-S. اخلط 196 µL من DAB المُحضّر حديثاً مع 4 µL من مثبط RNA. وقبل إضافة المحلول إلى المقطع مباشرةً، اترك DAB يتفاعل لمدة دقيقة إلى دقيقتين، يليه غسيل بـ A-D-E-P-C-P-B-S. بعد ذلك، قم بتجفيف المقاطع عن طريق الحضن لبضع ثوانٍ في الإيثانول المطلق، ثم هز الشرائح لتجفيفها تمهيداً للانتقال إلى LCM.

بعد ذلك، ضع 50 µL من محلول التحلل (lysis buffer) من طقم استخلاص RNA في غطاء أنبوب الجمع. ثم ضع شريحة واحدة تحت المجهر بحيث يكون جانب العينة مواجهاً للغطاء. اختر أفضل تكبير للعينة واضبط التركيز لرؤية الخلايا المستهدفة.

بعد ذلك، حدد منطقة القطع وابدأ عملية القطع باستخدام الليزر. قم بجمع المواد المستقطعة في غطاء أنبوب التجميع، ثم قم بحضن الخلايا المجموعة لمدة 30 دقيقة عند 42 درجة مئوية. وخلال هذه الفترة، قم بتهيئة عمود تنقية RNA من طقم استخلاص RNA باستخدام 250 µL من محلول التكييف (conditioning buffer).

ثم أضف 50 µL من الإيثانول إلى الخلايا المحللة الموجودة في العمود، ثم قم بطرد العمود مركزياً لمدة دقيقتين بسرعة 16,000 Gs وفي درجة حرارة الغرفة، يليه غسل العمود مرتين باستخدام محلول الغسيل المنظم. وأخيراً، قم باستخلاص الـ RNA في الحد الأدنى من الحجم الموصى به وهو 11 µL من الماء الخالي من الـ RNA، مع الاحتفاظ بـ 2 µL جانباً لاختبار جودة الـ RNA. تتيح إجراءات الوسم المناعي السريعة هذه رؤية الخلايا المستهدفة مع الحفاظ على سلامة الـ RNA التجريبي.

اعتماداً على التجربة، يمكن استخدام تقنية LCM كما تم توضيحها لعزل خلايا مفردة أو مناطق اهتمام أكبر. يؤثر تحلل RNA بشكل كبير على جودة التحليلات اللاحقة. لذا، يتمت معالجة كل عينة بشكل إضافي على منصة bioanalyzer تعتمد على تقنية microfluid X للسماح بقياس كمية RNA المعزول والتحقق من سلامته كما تم توضيحه للتو.

على سبيل المثال، تظهر هنا نتائج نموذجية لجهاز bioanalyzer لكل من عينات RNA المتدهورة وعالية الجودة. وبالفعل، يوضح الهلام الرقمي والمخططات الكهربائية أهمية استخدام مثبط rase في كل محلول لحماية الـ RNA. وباتباع هذا الإجراء، يمكن معالجة الـ RNA عالي الجودة بشكل إضافي للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك تسلسل RNA أو MICROARRAY أو Q-R-D-P-C-R؛ فعلى سبيل المثال، في هذه الرسوم البيانية، تم تحديد متوسط الإثراء للتعبير الجيني لـ TH و A A DC في العينة المستأصلة مجهرياً مقارنة بمقاطع الدماغ المتوسط بأنه يزيد عن 170 ضعفاً.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل بسرعة كبيرة وباستخدام أدوات خالية من الـ RNAs. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مجموعة محددة من الخلايا من أي نسيج.