عزل الحمض النووي الريبي من خلية مجموعات سكانية فرعية محددة عن طريق الليزر والتقاط تسليخ مجهري جنبا إلى جنب مع رابيد Immunolabeling

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية إجراء وضع العلامات المناعية السريعة لخلايا دماغ الفئران المعزولة عن طريق الالتقاط بالليزر أو التشريح الدقيق أو المضاعف المشترك الأصغر مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي للعينات. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميد أنسجة المخ المقطعة بسرعة أولا. ثم يتم تقطيع الدماغ إلى أقسام رفيعة على شرائح مجهر زجاجي خال من الحمض النووي الريبي ومعالجته بتلطيخ مناعي سريع.

أخيرا ، يتم عزل مجموعة الخلايا ذات الأهمية باستخدام المضاعف المشترك الأصغر للنمو. في النهاية ، يسمح التلوين السريع متبوعا بالتشريح الدقيق لالتقاط الليزر بتحديد التغييرات في التعبير عن الجين محل الاهتمام في عينة الخلية التجريبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت ، هي أنه باستخدام تقنيتنا ، يتم الحفاظ على الدقة المكانية مما يسمح بحل خلية معينة من ES من الأنسجة المحيطة.

بشكل عام ، سوف يدور الأشخاص الجدد في خلية سميث هذه لأن هذا الإجراء يتضمن العديد من الخطوات الحاسمة التي تتطلب العمل بسرعة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في العينات. لتحضير العينات للتقسيم ، قم بتشريح الأدمغة من اليوم الأول لفئران ما بعد الولادة في وسط الجليد البارد L 15 في غضون دقيقتين من التضحية. بعد ذلك ، ضع الأدمغة في قوالب التضمين في الاتجاه المناسب للتقسيم وملء القوالب بالأنسجة المجمدة ، وتضمين الوسائط.

ثم قم بتجميد العينات على الفور في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر في غضون 30 ثانية من التجميد المفاجئ. الآن ، قم بمعالجة الشرائح الزجاجية المطلية بالغشاء بإزالة تلوث الحمض النووي الريبي السطحي لإزالة أي كميات ضئيلة من الحمض النووي الريبي. اشطفها بماء DEPC واتركها تجف في الهواء عندما تجف الشرائح.

اضبط درجة حرارة غرفة ناظم التبريد على 20 درجة مئوية تحت الصفر وانقل العينة المجمدة إلى جهاز التبريد. لكل عينة ، قم بتركيب الكتلة المجمدة على مشبك العينة وقم بتقطيع العينات بسماكة 10 ميكرون ، وجمع الأقسام على الشرائح المطلية بالغشاء. بعد ترك الأقسام تجف لمدة 10 دقائق على الأقل ، استخدم قلم حاجز مسعور لتطويق الأنسجة.

بعد حوالي 10 ثوان ، ضع الشرائح في محلول مثبت بارد طازج لمدة لا تزيد عن خمس دقائق عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. الآن انقل الشرائح إلى صينية نظيفة معالجة مسبقا بمحلول إزالة تلوث الحمض النووي الريبي السطحي. أولا ، قم بهز الشرائح مرة واحدة لإزالة أي مثبت زائد واغسلها بستة إلى ثمانية غموسات سريعة في D-E-P-C-P-B-S قم بنفض التمرير على الشرائح.

لإزالة D-E-P-C-P-B-S الزائدة ، أضف 200 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي لكل قسم. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الشرائح بثلاث غموسات سريعة في D-E-P-C-P-B-S وقم بنقرها مرة واحدة لإزالة محلول الغسيل الزائد. ثم احتضان العينات في 200 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة بعد ست دقائق.

اغسل الشرائح في D-E-P-C-P-B-S كما هو موضح للتو واحتضنها في محلول BC المعد حديثا لمدة أربع دقائق بعد مزيج غسيل سريع آخر D-E-P-C-P-B-S 196 ميكرولتر من DAB المحضر حديثا مع أربعة ميكرولتر من مثبط الحمض النووي الريبي. قبل إضافة المحلول إلى القسم مباشرة ، اترك DAB يتطور لمدة دقيقة إلى دقيقتين ، متبوعا بغسل A-D-E-P-C-P-B-S. ثم قم بتجفيف الأقسام ببضع ثوان من الحضانة في الإيثانول المطلق ونفض التمرير السريع للشرائح حتى تجف للانتقال إلى LCM.

بعد ذلك عند 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتحلل من مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي في غطاء أنبوب التجميع. ثم ضع شريحة واحدة تحت المجهر بحيث يكون جانب العينة مواجها للغطاء. اختر أفضل تكبير للعينة واضبط التركيز لرؤية الخلايا ذات الاهتمام.

ثم حدد منطقة القطع وابدأ في القطع بالليزر. جمع المواد التي تم تشريحها في غطاء أنبوب التجميع للخلايا المجمعة لمدة 30 دقيقة عند 42 درجة مئوية. خلال هذا الوقت ، قم بتكييف عمود تنقية الحمض النووي الريبي مسبقا من مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي ب 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتكييف.

ثم قم بتحميل 50 ميكرولترا من الإيثانول على الخلايا المحللة على العمود وقم بالطرد المركزي للعمود لمدة دقيقتين عند 16،000 Gs ودرجة حرارة الغرفة متبوعة بشطفتين مع محلول الغسيل. أخيرا ، قم بتصفية الحمض النووي الريبي في الحد الأدنى الموصى به وهو 11 ميكرولترا من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي مع الاحتفاظ بميكرولترين جانبا لاختبار جودة الحمض النووي الريبي. يسمح إجراء وضع العلامات المناعية السريع هذا بتصور الخلايا ذات الأهمية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي التجريبي.

اعتمادا على التجربة ، يمكن استخدام المضاعف المشترك الأصغر كما هو موضح للتو لعزل الخلايا المفردة أو مناطق أكبر ذات الأهمية. الحمض النووي الريبي المتحلل له تأثير كبير على جودة التحليل النهائي. وبالتالي تتم معالجة كل عينة بشكل أكبر على محلل حيوي قائم على microfluid X للسماح بالقياس الكمي والتحقق من سلامة الحمض النووي الريبي المعزول كما هو موضح للتو.

على سبيل المثال ، هنا ، نتائج المحلل الحيوي النموذجية ذات نوعية متدهورة وجيدة. يتم عرض عينات الحمض النووي الريبي. في الواقع ، يوضح الجل الرقمي والمخططات الكهربائية أهمية استخدام مثبط rase في كل محلول لحماية الحمض النووي الريبي باتباع هذا الإجراء ، ويمكن معالجة الحمض النووي الريبي عالي الجودة بشكل أكبر للتطبيقات النهائية ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي MICROARRAY أو Q-R-D-P-C-R ، على سبيل المثال ، في هذه الرسوم البيانية ، تم تحديد متوسط التخصيب للتعبير الجيني TH و A A DC في العينة الدقيقة التشريح بالنسبة لأقسام منتصف الدماغ ليكون أكثر من 170 ضعفا.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بسرعة كبيرة ومع مواد خالية من الحمض النووي الريبي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل مجموعة معينة من الخلايا عن أي نسيج.