Name: بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: تعلم طريقة التنبيغ اللينفيروسي للأورجانويدات المعوية الأولية باستخدام جسيمات فيروسية عالية التركيز. يتيح هذا البروتوكول إجراء تعديلات جينية موثوقة في نموذج خارج الجسم لدراسة علم الأحياء المعوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J. Heijmans مدعوم بمنح من مؤسسة السرطان الهولندية (KFW). يتم دعم G.R. van den Brink بتمويل من مجلس البحوث الأوروبي في إطار برنامج الإطار الإطاري السابع للمجموعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) / اتفاقية منحة مجلس البحوث الأوروبي رقم 241344 وبمنحة VIDI من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (GvdB).

1. إعداد Polyethylenimine (PEI) كما ترنسفكأيشن الكاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل حوالي 150 ملغ من PEI إلى 100 ​​مل من H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط حل لدرجة الحموضة 7.4 بإضافة حمض الهيدروكلوريك حتى يصبح حل واضح ويقلب حتى يذوب تماما. وهذا قد يستغرق ما بين 10 و 60 دقيقة والمياه إضافة إلى تركيز نهاية 1 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما اضح، تصفية حل PEI من خلال معقم مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية في aliquots من 5 مل. </li></ol> 2. إنتاج Lentiviral الجسيمات اليوم 1: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا HEK293T انقسم الى 60٪ -80٪ confluency في 162 سم 2 قارورة أو طبق بتري كبير في خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 2 ملي الجلوتامين الملحق). </li></ol> يوم 2: <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DNA الحل ترنسفكأيشن التي تحتوي على 45 ميكروغرام من إجمالي DNA البلازميد بإضافة معاناقلات lentiviral التعبئة والتغليف (7 ميكروغرام من pVSVg، 5 ميكروغرام من pRSV مراجعة (13)؛ ميكروغرام من pMDL) و 20 ميكروغرام من البلازميد lentiviral ترميز الجينات في المصالح أو shRNA من الاهتمام. التكيف مع حجم 1 مل باستخدام DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PEI الحل ترنسفكأيشن من خلال إضافة 90 ميكرولتر من 1 ملغ / مل PEI إلى 930 ميكرولتر من DMEM واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DNA الحل ترنسفكأيشن إلى حل PEI. دوامة أو عكس عدة مرات واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حل ترنسفكأيشن الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالتنقيط 2 مل من محلول ترنسفكأيشن الحمض النووي على الخلايا HEK293T واحتضان لمدة 4 ساعات في ترطيب حاضنة الثقافة خلية على 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 4 ساعات، وتحديث مستنبت لإزالة PEI. وليس من الضروري أن يغسل خلايا قبل أن يضيف الوسيلة الجديدة. ملاحظة: PEI غير السامة للخلايا وحضانة مرات أطول من 4 ساعات قد يسبب ضررا للخلايا HEK293T. </li></ol> اليوم 4: <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال سوبrnatant مع الجديد مستنبت. الحفاظ طاف (التي تحتوي على فيروس)؛ هذا وسوف تستخدم في الخطوة 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طاف في 15 مل قارورة. لإزالة الخلايا الميتة، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع طاف من خلال 0.45 ميكرون فلتر باستخدام حقنة كبيرة 60 مل. تخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol> يوم 5: <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدفعة الثانية من طاف. الطرد المركزي ومرشح كما هو الحال في الخطوات 2،8-2،9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع supernatants من الخطوات 2.9 و 2.10 في أنابيب نابذة فائقة السرعة وأجهزة الطرد المركزي في 50،000 x ج في نابذة فائقة السرعة لمدة 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ بها كبسولات تحتوي على أنابيب نابذة فائقة السرعة بعناية فائقة ووضعها في غطاء تدفق الصفحي، وتذكر التوجه من الأنبوب داخل أجهزة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كبسولة مفتوحة عقد أنبوب نابذة فائقة السرعة والمتوسطة صب بعناية في مثل هذه الأزياء التي بيليه على الجانب العلوي من الأنبوب. منذ الكريات الفيروسية قد يكون من الصعب تصور، تذكر على ماجانب من أنبوب بيليه سيكون قد تشكلت. اتخاذ ممص مكروى وإزالة الجزء الأخير من المتوسط ​​مع الحرص على عدم تستنهض الهمم بيليه البني مبهمة التي مرئيا على جانب من الجزء السفلي من أنبوب نابذة فائقة السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend هذا بيليه في 500 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع 10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021، 10 ميكرومتر Y27632 و 8 ميكروغرام / مل polybrene. إعادة تعليق في هذه الوسيلة هي مهمة منذ يستخدم الفيروس عيار عالية لtransduct organoids مباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: تجميد الفيروس في هذه الوسيلة aliquoted على دفعتين من 250 ميكرولتر في -80 ° C. </li></ol> 3. Lentiviral تنبيغ من Organoids اليوم 0: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم كامل 0.95 سم 2 جيدا organoids يومين قبل تنبيغ في بئر جديد، وتهدف إلى الحصول على ما يقرب من 50 organoids صغير. تقسيم organoids وفقا لبروتوكول نشرت سابقا 1 (الشكل 3A، B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكملة عضي مستنبت مع 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ملي نيكوتيناميد للحصول فرط الكيسي أقبية التكاثري (الشكل 3C). ملاحظة: سوف أقبية الكيسي تطوير أفضل عندما تزرع organoids تقسيم حديثا في وجود Chir99021. </li></ol> يوم 2: <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> organoids الحصاد قبل pipetting صعودا ونزولا على matrigel والمتوسطة، وبالتالي تعطيل الخليط مع ممص مكروى P1000. ضع الخليط في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل باستخدام مزيد من باستور الماصة التي قد انخفضت افتتاح البعيدة عن ذوبان. organoids أجهزة الطرد المركزي لتكوير لمدة 5 دقائق في 100 × ز. ملاحظة: تعتمد على حجم الطرد المركزي، واستخدام سرعة أجهزة الطرد المركزي مختلفة. فمن الضروري للعثور على سرعة الدقيقة التي تعطلت يتم فصل organoids من الخليط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر من قبل تحسنت التربسين 1X (على غرار 0.25٪ التربسين). و resuspend organoids في التربسين واحتضان3 دقيقة في 37 ° C حمام الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل التربسين بإضافة 3.5 مل من خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين والجلوتامين). أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف لترك بيليه في حوالي 20 ميكرولتر من المتوسط. نقل organoids في هذا المبلغ صغير الأخير من المتوسط ​​في بئر على طبق من ذهب 48-الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة العالية عيار الفيروسة البطيئة في التنبيغ المتوسطة كما هو موضح في الخطوة 2.14، في resuspend وانتقل إلى الخطوة 3.10. عندما تواجه منخفضة التنبيغ فعالية، خطوة 3.9 ويمكن أن يضاف. ملاحظة: للحصول على التنبيغ كفاءة، وعادة إضافة قسامة واحدة من 250 ميكرولتر من ارتفاع عيار الفيروسة البطيئة للبئر واحدة من organoids. وهذا يمثل 50٪ من جميع الفيروسة البطيئة تحصد من إنتاج واحد كما هو موضح في الخطوة 2 من هذا البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، نفذ spinoculation من خلال وضع لوحة تحتوي على الآبار organoids 48 في مرحلة ما قبل درجة حرارة الطرد المركزي على 326؛ C وتدوير في 600 x ج لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع خليط فيروس عضوي الشكل في الثقافة الحاضنة واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة للسماح التنبيغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، واحتضان organoids لمدة 3 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من عضوي الشكل مستنبت و resuspend خليط فيروس عضوي الشكل، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge لمدة 5 دقائق في 850 x ج لتكوير organoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend بيليه في 20 ميكرولتر من matrigel الجليد الباردة. منذ المواد يتصلب عندما يصبح أكثر دفئا، واستخدام نصائح ماصة التي توترت بسبب pipetting صعودا وهبوطا الجليد PBS البارد لعدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة في منتصف بئر في لوحة 48 بئرا واحتضان في حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 15 دقيقة، إضافة بعناية 250 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ميكرومتر Y27632. سوف شظايا عضي تعطلت صغيرة تشكل في organoids الكيسي صغير خلال 24 ساعة. </li></ol> يوم 5: <ol start="16" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديث المتوسطة وتكملة مع مضاد حيوي التحديد (لبوروميسين، استخدم 4 ميكروغرام / مل). </li></ol> يوم 7: <ol start="17" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة لمعيار مستنبت عضي، على أن تستكمل مع اختيار المضادات الحيوية. ملاحظة: سوف الناشيء تكون كاملة 2-3 أسابيع بعد Chir99021 الانسحاب. بعد الاختيار، قد نمت organoids دون اختيار المضادات الحيوية. </li></ol> 4. عضي إعداد RNA لالكمي RT-PCR أو ميكروأري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد RNA، واستخدام عدة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. إزالة المتوسطة من organoids وإضافة 350 ميكرولتر من العازلة RLT، على أن تستكمل مع β المركابتويثانول مباشرة على قبة matrigel تحتوي على organoids. Resuspend والعتادالقاعدة في RLT من قبل pipetting باستخدام P1000 ممص مكروى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مزيد من الإعدادية RNA وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: زيادة الغلة RNA عن طريق التضخيم باستخدام نظام الحفاوة بيكو WTA، والتي تتطلب مدخلات الأولي من 50 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا: لمراقبة الجودة قبل RNA ميكروأري، تشغيل العينات على 2100 bioanalyzer باستخدام حقيقي النواة مجموع RNA نانو رقاقة، وتهدف لعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) من 8.5 أو أكثر (الشكل 5) وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li></ol> 5. معالجة Organoids لتضمين البارافين والمناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الشروع في عضي تضمين ما قبل الحارة كتلة الألومنيوم مع الثقوب لتركيب 12 ملم أنابيب زجاجية قطرها في حاضنة عند 70 درجة مئوية للحفاظ على البارافين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ بئر واحد مع organoids كامل نما وإزالة المتوسطة، وترك organoids جزءا لا يتجزأ سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ملمن بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني مباشرة إلى جيدا وإصلاح في 4 درجات مئوية في أي مكان من 1 ساعة ليلة وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال بارافورمالدهيد مع 1 مل من الجليد الباردة PBS. اختياريا: الحفاظ على organoids الثابتة في برنامج تلفزيوني يصل إلى 1 في الاسبوع عند 4 درجة مئوية بعد هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend organoids الثابتة في 1 مل من برنامج تلفزيوني ومكان في زجاج القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح organoids تنزل الى القاع لمدة 1 دقيقة، صب PBS واستبدالها مع 70٪ من الإيثانول التي يتم فيها حل بضع قطرات من محلول يوزين لتمكين التصور من organoids في جميع مراحل عملية التضمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك organoids في 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، وإزالة 70٪ من الإيثانول عن طريق الصب بعناية، والقدرة على تصور organoids قبل العين بسبب بسيط وردي اللون يوزين. استبدال تضمين حل مع 96٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 5.7، في كل مرة يحل محل الحل تضمين مع واحد القادم. تمرير organoids من خلال الحلول التالية لاحقا: 70٪ من الإيثانول و 90٪ من الإيثانول و 96٪ من الإيثانول، و 100٪ الإيثانولنول، و 100٪ من الإيثانول، الزيلين والزيلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب غسل زيلين الماضي وتصب البارافين في أنبوب. وضع أنبوب على الفور في مرحلة ما قبل درجة حرارة كتلة الألومنيوم عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، واستبدال البارافين مع البارافين نظيفة الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب البارافين قبالة والماصة organoids في القالب كتلة البارافين باستخدام درجة حرارة ما قبل باستور الماصة مع فتحة كبيرة. الحفاظ باستور الماصة دافئة باستخدام موقد بنسن. وضع كافة organoids في قالب كتلة البارافين في طبقة صغيرة من البارافين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قدر الإمكان، في محاولة للتلاعب كل organoids نحو وسط القالب كتلة البارافين باستخدام إبرة تشريح تحسنت. حافظ على تشريح إبرة دافئة باستخدام بنسن الموقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما توطين organoids في قالب غير مرضية، والبرد القالب قليلا ليصلب طبقة البارافين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتهاء من كتلة بصب المزيد من البارافين على رأس وإضافة معيار النسيجي التضمين الكاسيت. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يصف بروتوكول الفيديو الحالي تنبيغ lentiviral من organoids من ظهارة الأمعاء الأولية وتحليل المصب من هذه organoids باستخدام تقنيات RNA الكمية والمناعية. وغالبا ما يقوم التنبيغ Lentiviral في الخلايا الملتصقة أو العائمة في لوحات الثقافة. منذ هيكل ثلاثي الأبعاد من organoids يجعل من الصعب اختراق من قبل الجسيمات الفيروسية، ويتم استخدام عدد من الأساليب لزيادة الفعالية. المعالجة المسبقة لorganoids باستخدام Chir99021 يزيد ...

الظهارة المعوية هي واحدة من أنسجة الجسم المتكاثرة بسرعة أكبر، الأمر الذي تسبب بها لجذب اهتمام واسع من البحوث على الخلايا السرطانية والجذعية. في عام 2009 تم نشر تقنية لتوليد الثقافات طويلة الأمد من الخبايا المعوية صغيرة في matrigel، والحفاظ على الأبعاد هيكل 1 3. هذه الهياكل، وصف organoids الأمعاء، يمكن تربيتها باستخدام تقنيات القياسية، مع توضيح تستكمل المتوسطة مع عدد من عوامل النمو محددة، بما في ذلك BMP-يشير مسار المانع رأس (نوج)، وWNT-يشير محسن مسار rspondin 1 (Rspo1) و عامل نمو البشرة (EGF) وجد كل لتعزيز انتشار الأمعاء 2-4. Organoids تجاوز خطوط الخلايا السرطانية التقليدية في الجوانب التي هم غير المتحول، حافظوا على التسلسل الهرمي الخلايا الجذعية، وعرض الاستقطاب الخلوي سليمة ومعرض التمايز في جميع الأنساب الخلية وجدت في كثافة العمليات الصغيرة الوليدةظهارة estinal. لأنها يمكن transduced للقيام الجينات المحورة أو تدخل RNA يبني 5، وأنها تستخدم لدراسة عناصر وراثية محددة، تفوق التجارب باستخدام الفئران المعدلة وراثيا في جوانب التكلفة والسرعة. التعبير المعدلة وراثيا في organoids يمكن القيام بها باستخدام إما فيروسات أو الفئران ناقلات lentiviral 6،7. بسبب القيود المفروضة على الفيروسات القهقرية الفئران، قادرة على transducing الخلايا الإنقسامية حصرا 8، هو أكثر كثيرا ما تستخدم تنبيغ lentiviral للخلايا التي يصعب أن تصيب، مثل organoids. transduced فيروسي والتعبير عن ثابت organoids المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للعديد من التحليلات المصب، بما في ذلك RNA الكمي التحليلات والمناعية. أخذت معا، وتطورت ثقافة organoids من الخلايا الظهارية في الأمعاء الأولية في تقنية الروتينية التي هي سهلة لتنفيذ دون متطلبات مختبر معينة، وأصبحت المعيار رواية في مالثقافة ليرة لبنانية في البحث على ظهارة الأمعاء. تقنيات تنبيغ الفيروسية وتحليل المصب لاحق في organoids هي شاقة لأداء وللمساعدة تجارب عضي ولدت لنا هذا البروتوكول الفيديو، والتي تبين طرق lentiviral تنبيغ organoids مثقف. وتبين لنا بالإضافة إلى ذلك كيف يصح تجهيز organoids يمكن زيادة الغلة، وبالتالي تعزيز أداء تحليل المصب باستخدام تقنيات RNA أو المناعية. في البروتوكول، واستخدمت organoids التي هي مستمدة من الخبايا المعوية الصغيرة حصرا، على الرغم من أن التقنيات الموضحة يمكن تطبيقها على organoids القولون أيضا.

<table><tbody><tr><td>البولي إيثيلين إيمين</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM متوسط</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>مصل ربلة الساق الجنينية</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>الجلوتامين</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>متقدم DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>ماوس Egf</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>جلوتاماكس 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>بوليبرين</td><td>سيجما</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>نيكوتيناميد</td><td>سيجما</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>تريبسين</td><td>لونزا</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>بورومايسين</td><td>سيجما</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة صغيرة من Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr> <tr><td>&# 946 ؛ -mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>8،057،400،250</td><td></td></tr> نظام <tr><td>Ovation Pico WTA</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>قارورة زجاجية مخروطية 12 &nbsp ؛ مم × 75 &nbsp ؛ مم 5 &nbsp ؛ مل</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Yellowish</td><td>VWR</td><td>1،159،350،025</td><td></td></tr></tbody></table>

بروتوكول لlentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية organoids

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

يمكن الاحتفاظ ب هياكل الزغابات المعوية التي تسمى العضيات ، في ثقافة مستدامة ثلاثية الأبعاد عند استكمالها بعوامل النمو المناسبة. نظرا لأن العضيات تشبه إلى حد كبير الأنسجة الأصلية من حيث تمايز الخلايا الجذعية المتجانسة وقطبية الخلية ووجود جميع أنواع الخلايا المتمايزة نهائيا المعروفة لظهارة الأمعاء البالغة ، فإنها تعمل كمورد أساسي في البحث التجريبي على الظهارة. أدت إمكانية التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا أو الحمض النووي الريبي المتداخل باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية أو الفيروسات القهقرية في الأعضاء إلى زيادة فرص التحليل الوظيفي للظهارة المعوية والخلايا الجذعية المعوية ، متجاوزة الجينات المعدلة وراثيا التقليدية للفأر من حيث السرعة والتكلفة. في بروتوكول الفيديو الحالي ، نوضح كيفية استخدام نقل العضيات المعوية الدقيقة مع نواقل الفيروس الموضحة باستخدام الجينات المعدلة وراثيا المحفزة الدوكسيسيلين ، أو الحمض النووي الريبي القصير المحفز IPTG للإفراط في التعبير أو ضربة قاضية للجينات. علاوة على ذلك ، بالنظر إلى أن الثقافة العضوية تنتج عددا دقيقا للخلايا يمكن تقليله عن طريق العلاج التجريبي ، فإننا نوضح كيفية معالجة العضيات لتحليل المصب الذي يهدف إلى RT-PCR الكمي و RNA-المصفوفة الدقيقة والكيمياء المناعية. تساهم التقنيات التي تمكن من التعبير الجينات المعدلة وإسقاط الجينات في العضيات المعوية في إمكانات البحث التي تحملها هذه الهياكل الظهارية المعوية ، مما يؤسس للثقافة العضوية كمعيار جديد في زراعة الخلايا.

تنبيغ lentiviral عضوي الشكل تقنية التنبيغ عضوي الشكل باستخدام الجزيئات lentiviral تعتمد على المعالجة الصحيحة للorganoids قبل وأثناء التنبيغ. كانت Organoids (الشكل 3A) مثقف وأنها تعطلت في أقبية واحدة (الشكل 3B). كما ذكرت سابقا، أصبحت هذه الأقبية واحدة، عندما مثقف في وجود المانع GSK3 Chir99021 أقبية الكيسي 9 (الشكل 3C). وفي وقت لاحق تم trypsiniz...

في بروتوكول الفيديو هذا ، نقدم شرحا خطوة بخطوة لنقل الفيروسات في العضيات في ظهارة الأمعاء الأولية ومعالجة وتحليل المصب لهذه الثقافات عن طريق RT-PCR و RNA-microarray والكيمياء المناعية.

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج عضوانيات مُحوّلة جينياً بشكل مستقر من ظهارة الأمعاء الأولية للفأر لإجراء تحليلات لاحقة على عضوانيات الأمعاء. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ترانسفكشن خلايا HEC 2 93 T بنواقل التعبئة اللينتيفيروسية وبلازميد لينتيفيروسي يشفر الجين المراد دراسته لإنتاج جزيئات لينتيفيروسية ذات عيار عالٍ. وتتمثل الخطوة الثانية في المعالجة المسبقة لعضوانيات الأمعاء المستنبتة من الفأر بعدد من عوامل النمو للحصول على خبايا تكيسية مفرطة التكاثر.بعد ذلك، يتم نقل الجينات إلى العضوانيات باستخدام الفيروس البطيء ذو العيار العالي، ثم تُحضن العضوانيات المنقولة في الماتريجيل (matrigel). وتتمثل الخطوة النهائية في دمج العضوانيات المنقولة مكتملة النمو في البارافين لإجراء تحليل الكيمياء النسيجية المناعية لاحقاً. وفي النهاية، يُستخدم نقل الجينات للفيروس البطيء في العضوانيات لإحداث تغييرات جينية في نموذج مخبري للظهارة المعوية يتميز بالموثوقية والقابلية للتكرار والسرعة.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الخطوط الخلوية السرطانية، في أن العضوانيات تمثل تسلسلاً هرمياً للخلايا الجذعية المزاحة وغير المتحورة. وفيما يتعلق بالاستقطاب الخلوي، يمكنها التمايز إلى جميع أنواع الخلايا المختلفة لظهارة الأمعاء الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العضوانيات المنقولة جينياً لدراسة عناصر وراثية محددة، مما يجعلها تتفوق على استخدام الفئران المعدلة وراثياً من حيث التكلفة والسرعة.تعد عملية إنتاج الجزيئات الفيروسية البطيئة (lentiviral particles) بروتوكولاً يستغرق خمسة أيام، يبدأ بتقسيم خلايا HEC 2 93 T لتصل كثافتها إلى 60 إلى 80% في دورق بمساحة 162 سنتيمتراً مربعاً يحتوي على وسط زراعة الخلايا. تُحضن الخلايا طوال الليل في حضانة زراعة خلايا رطبة عند درجة حرارة 37 °C. وفي اليوم التالي، يتم تحضير محلول ترنسفكشن DNA ومحلول ترنسفكشن البولي إيثيلين إيمين (polyethylene amine) أو PEI كما هو موضح في نص البروتوكول.أضف محلول ترانسفكشن الـ DNA إلى محلول الـ PEI مع الرج باستخدام جهاز الفورتكس أو القلب لعدة مرات، ثم حضّن الخليط لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتنقيط 2 mL من محلول ترانسفكشن الـ DNA زائد الـ PEI فوق خلايا HEC 2 93 T، ثم حضّنها لمدة أربع ساعات عند 37 °C.قم بتجديد وسط الزرع. لإزالة PEI، قم بتحضين الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة Celsius، وفي اليوم الرابع، اجمع supernatant في أنبوب سعة 50 milliliter. أضف وسط زرع جديد إلى الخلايا وأعد القارورة إلى المحضنة، ثم قم بطرد supernatant الذي تم جمعه مركزياً عند 500 Gs لمدة خمس دقائق.لإزالة الخلايا الميتة، استخدم سرنجة كبيرة سعة 60 milliliter لدفع الـ SUPERNAT عبر مرشح بمقاس 0.45 micrometer. قم بتخزين الـ supernat المرشح طوال الليل في درجة حرارة أربعة degrees Celsius. وفي اليوم التالي، قم بجمع وطرد مركزي وترشيح الدفعة الثانية من الـ supernatant كما تم توضيحه في الدفعة الأولى.اجمع الدفعتين من السائل الطافي في أنابيب طرد مركزي فائقة. قم بإجراء الطرد المركزي عند 50,000 GS لمدة 90 دقيقة. عند اكتمال عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الكبسولات التي تحتوي على أنابيب الطرد المركزي الفائقة بحذر شديد، وضعها داخل غطاء تدفق رقائقي.افتح الكبسولة التي تحتوي على أنبوب الطرد المركزي الفائق وقم بسكب الوسط بعناية مع إبقاء الراسب في الجانب العلوي من الأنبوب. من المهم تذكر الجانب الذي تشكل فيه الراسب داخل الأنبوب لأن رواسب الفيروسات قد يصعب رؤيتها. بعد ذلك، استخدم ماصة دقيقة لإزالة الكمية الأخيرة من الوسط مع الحرص على عدم تحريك الراسب البني المعتم المرئي على الجانب السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق.أعد تعليق هذه الكتلة في 500 µL من وسط زراعة العضوانيات المكمل بمثبطات nicotinamide kinase و poly brain resus. يُعد التعليق في هذا الوسط أمراً هاماً نظراً لاستخدام الفيروس ذو العيار المرتفع مباشرةً لنقل الجينات إلى العضوانيات قبل يومين من عملية النقل. قم بنقل محتويات بئر كامل من العضوانيات بمساحة 0.95 cm² إلى بئر جديد في طبق زراعة مكون من 48 بئراً.بناءً على بروتوكول تم نشره مسبقاً. الهدف هو الحصول على 50 عضوانياً صغيراً تقريباً في زراعة العضوانيات. يتم استخدام وسط مضاف إليه مثبط لإنزيم glycogen synthase kinase والنيكوتيناميد.للحصول على خبايا تكاثرية مفرطة كيسية، يتم تحضين العضوانيات لمدة يومين. وفي يوم نقل الجينات، تُجمع العضوانيات باستخدام ماصة دقيقة P 1000. تُسحب مادة الماتريجيل والوسط الغذائي صعوداً وهبوطاً بواسطة الماصة، مما يؤدي إلى تفكيك الخليط.ضع الخليط في أنبوب سعة 15 milliliter. قم بتفكيك الخليط بشكل أكبر باستخدام ماصة PEs تم تضييق فتحتها الطرفية عن طريق الصهر. قم بترسيب العضوانيات عن طريق الطرد المركزي عند 100 Gs لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة الطافي، وأضف 500 microliters من trypsin بتركيز 1x مسبق التدفئة وأعد تعليق العضوانيات، ثم حضنها لمدة ثلاث دقائق.في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C، قم بتثبيط إنزيم trypsin بإضافة 3.5 milliliters من وسط زراعة الخط الخلوي، ثم قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 500 Gs. تخلص من السائل الطافي مع ترك الراسب في حوالي 20 microliters من الوسط. انقل العضوانيات الموجودة في هذه الكمية الصغيرة المتبقية من الوسط إلى بئر.في طبق يحتوي على 48 بئراً، أضف الفيروس lentivirus عالي العيار المُحضَّر مسبقاً في وسط ترنسدكشن (transduction medium) إلى العضوانيات (organoids) وأعد تعليقها. حضّن خليط العضوانيات والفيروس لمدة ساعة واحدة عند 37 °C في حاضنة زراعية للسماح بعملية الترنسدكشن، وبعد مرور ساعة واحدة، أضف 1 mL من وسط زراعة العضوانيات إلى خليط العضوانيات والفيروس، وأعد التعليق، ثم انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، واطرد الخليط مركزياً عند 850 ×g لمدة خمس دقائق.لترسيب العضوانيات، قم بإزالة الطافي وإعادة تعليق الراسب. وفي 20 µL من Matrigel مبرد على الثلج، ضع القطرة في منتصف بئر في طبق يحتوي على 48 بئراً، ثم حضنها عند 37 °C لمدة 15 دقيقة.للسماح للقطيرة بالتصلب بعد 15 دقيقة. أضف بعناية 250 µL من وسط استنبات العضوانيات (organoid culture medium) المضاف إليه النيكوتيناميد ومثبطات الكيناز.قم بتسخين قالب من الألمنيوم مسبقاً في حاضنة عند 70 درجة Celsius للحفاظ على البارافين في حالته السائلة. قم بإزالة الوسط من بئر واحدة تحتوي على عضوانيات (organoids) مكتملة النمو مع ترك العضوانيات المدمجة سليمة، وأضف 1 mL من 4% Paraformaldehyde في PBS مباشرة إلى البئر. استبدل الـ Paraformaldehyde بـ 1 mL من PBS.أعد تعليق العضوانيات المثبتة في محلول PBS وانقلها إلى وعاء زجاجي. اترك العضوانيات لتترسب في القاع لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، اسحب محلول PBS باستخدام الماصة واستبدله بإيثانول بتركيز 70% المذاب فيه بضع قطرات من محلول الإيوسين.لتمكين رؤية العضوانيات طوال عملية التضمين، تُترك العضوانيات في 70%ethanol في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. يُزال 70%ethanol عن طريق السحب الماهر بالماصة. يمكن رؤية العضوانيات بالعين المجردة بسبب لون الإيوسين الوردي.استبدل محلول التضمين بـ 96% ethanol واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بهذه الطريقة. بعد ذلك، مرر العضوانيات عبر 70% ethanol، و90% ethanol، و96% ethanol، و100% ethanol، و100% ethanol، وxylene وxylene. صب غسلة الـ xylene الأخيرة ثم صب البارافين في القارورة الزجاجية.ضع القارورة فوراً في قالب الألمنيوم الذي تم تسخينه مسبقاً عند 70 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة. بعد مرور 30 دقيقة، استبدل البارافين ببارافين جديد ونظيف باستخدام ماصة PE أو ماصة أخرى تم تسخينها مسبقاً. صب البارافين للتخلص منه، واستخدم ماصة تم تسخينها مسبقاً ذات فتحة واسعة لسحب العضوانيات (organoids) ووضعها في قالب البارافين فوق طبقة من البارافين السائل.قم بتسخين إبرة تشريح باستخدام موقد بنزن وحرك جميع العضوانيات قدر الإمكان نحو مركز قالب كتلة البارافين. وعندما يكون توزيع العضوانيات في القالب مرضياً، برد القالب قليلاً لتصلب طبقة البارافين. أكمل تجهيز الكتلة عن طريق صب المزيد من البارافين في الأعلى وإضافة كاسيت تضمين نسيجي قياسي.في هذا البروتوكول، تم نقل الفيروسات البطيئة إلى عضوانيات الظهارة المعوية. تنمو العضوانيات الطبيعية في هياكل خبايا زغبية على شكل K مع عدد من الخبايا التي تخرج من نطاق زغبي مشترك. عند معالجة هذه العضوانيات بمثبط GSK three B، وهو CHIR 9 9 0 21، يزداد التكاثر وتصبح الخبايا كيسية بعد عملية نقل الفيروسات إلى العضوانيات.باستخدام الإفراط في تعبير EGFP عبر الفيروسات البطيئة، تُظهر العضوانيات تعبيراً لـ EGFP الفلوري. ولا يلزم إجراء خطوات تعزيز ترنسدكشن (transduction) التي قد تُنفذ عند انخفاض كفاءة الترنسدكشن، مثل التلقيح أو الحضن الفيروسي المطول، حيث أن هذه الخطوات لن تزيد من الكفاءة العالية بالفعل. بعد ذلك، تُعالج هذه العضوانيات لتقنيات RNA والكيمياء النسيجية المناعية. هذه الصورة التمثيلية عبارة عن مقطع عرضي لعضوانية معوية لفأر، مصبوغة بـ BRDU بعد الحضن مع BRDU لمدة ساعة واحدة قبل التثبيت.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقل الجينات إلى العضوانيات المشتقة من الظهارة المعوية الأولية باستخدام جسيمات الفيروسات البطيئة أو الفيروسات القهقرية.

a-protocol-for-lentiviral-transduction-downstream-analysis-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

هذا البروتوكول يفسر-Lgr5 POSITVE الثقافة عضي الأولية والأداء اللاحق للتنبيغ فيروسات. وهذا يتيح overexpression جنة المساواة العرقية، أو محرض ضربة قاضية من التحوير تسليمها ويسمح الدراسات الوظيفية التي يتعين الاضطلاع بها في الرواية في المختبر عضوي النمط   نظام نموذجي.

بروتوكول الفيديو من عدوى فيروسات الرجعية في الابتدائية المعوية عضي الثقافة

تنشأ من أقبية كله الثقافات أورجانويد المعوية ولا تسمح التحليل الذاتي تجديد والتمايز بطريقة خاصة بالخلية. ويصف هذا البروتوكول إعادة تشكيل الجذعية تم فرزها (Lgr5+) ومكانه الخلايا (بانته)، والتي تؤدي إلى أورجانويدس حين تمكينهم من قبل التعديل البيوكيميائية والوراثية والتحليل الوظيفي.

تحليل إعادة تشكيل أورجانويد (ORA) للتحليل الوظيفي الجذعية المعوية وخلايا متخصصة

نحن نصف تعليمات خطوة بخطوة إلى: 1) هندسة بكفاءة الأعضاء المعوية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية للاندوشن لينتي أو الرجعية، و، 2) توليد أقسام المجمدة من الأعضاء المهندسة. ويوفر هذا النهج أداة قوية لتغيير التعبير الجيني بكفاءة في الأعضاء للتحقيق في الآثار النهائية.

الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة

يصف هذا البروتوكول كيفية إصابة الأعضاء المعوية البشرية من جانبها apical أو basolateral لتوصيف التفاعلات المضيف / الممرض على مستوى الخلية الواحدة باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq).

تكييف الجهاز الهضمي للعدوى المسببة للأمراض وتسلسل الخلايا المفردة تحت ظروف السلامة البيولوجية المستوى 3 (BSL-3)

يقدم هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإنشاء عضويات الأمعاء الدقيقة الفئرانية ، وعزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 1 من الأمعاء الدقيقة الفئرانية الصفيحة propria، وإنشاء مزارع مشتركة ثلاثية الأبعاد (3D) بين كلا النوعين من الخلايا لدراسة التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا الظهارية المعوية والخلايا اللمفاوية الفطرية من النوع 1.

المشاركة في زراعة الأعضاء الظهارية في الأمعاء الدقيقة الفئرانية مع الخلايا اللمفاوية الفطرية

هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد عضويات معوية للفئران واستخدامها في العديد من التطبيقات النهائية. غالبا ما تكون الفئران نموذجا مفضلا قبل السريري ، ويملأ النظام العضوي المعوي القوي الحاجة إلى نظام في المختبر لمرافقة الدراسات في الجسم الحي .

توليد والتلاعب من العضويات المعوية الفئران

يصف هذا البروتوكول نهجا لإجراء تصوير الكالسيوم في العضويات المعوية البشرية المصابة بالفيروس ويقدم نهجا للتحليل.

تصوير الكالسيوم الحي للطبقات العضوية المعوية البشرية المصابة بالفيروس باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا

يجمع البروتوكول بين تقنية العضوية المعوية البشرية والتحليل النسخي أحادي الخلية لتوفير نظرة ثاقبة مهمة في بيولوجيا الأمعاء غير المستكشفة سابقا.

استخدام الكائنات العضوية المعوية البشرية لفهم ظهارة الأمعاء الدقيقة على مستوى النسخ أحادي الخلية

توضح هذه المقالة بروتوكول الرواية وكاشف مجموعة مصممة لقياس التأثيرات السمية العصبية الحساسة للمركبات والعلاجات على الثقافات المشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية باستخدام عالية تحليل المحتوى. تظهر النتائج ان ارتفاع تحليل المضمون يمثل تكنولوجيا جديدة مثيرة لتقييم العصبية.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

تعلم طريقة التنبيغ اللينفيروسي للأورجانويدات المعوية الأولية باستخدام جسيمات فيروسية عالية التركيز. يتيح هذا البروتوكول إجراء تعديلات جينية موثوقة في نموذج خارج الجسم لدراسة علم الأحياء المعوي.

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

استكشف المزيد من الفيديوهات