بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد عضيات منقولة بثبات من ظهارة الأمعاء الأولية للفأر لتحليل المصب للعضيات المعوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل خلايا HEC 2 93 T أولا بنواقل تغليف الفيروسات العدسية وبلازميد الفيروسات العدسية ، وترميز الجين المعني لإنتاج جزيئات فيروسات عدلية عالية. الخطوة الثانية هي المعالجة المسبقة للعضيات المعوية المزروعة للفأر بعدد من عوامل النمو للحصول على الخبايا التكاثرية الكيسية.

بعد ذلك ، قم بتحويل العضيات مع فيروس العدسات عالي العيار واحتضان العضيات المنقولة في ماتريجل. تتمثل الخطوة الأخيرة في تضمين العضيات المنقولة كاملة النمو في البارافين لتحليل الكيمياء المناعية النهائية. في النهاية ، يتم استخدام التنبيغ العضوي للفيروسات النسبية لتوليد تغييرات جينية في نموذج مختبري للظهارة المعوية موثوق به وقابل للتكرار وسريع.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل خطوط الخلايا السرطانية ، هي أن العضيات هي تسلسل هرمي للخلايا الجذعية النازحة غير المتحولة. في الاستقطاب الخلوي النصي ، يمكن أن يتمايز إلى جميع أنواع الخلايا المختلفة لظهارة الأمعاء الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام العضيات المحولة لدراسة عناصر وراثية معينة ، وبالتالي تفوق استخدام الفئران المعدلة وراثيا وجوانب التكلفة والسرعة.

إنتاج جزيئات الفيروسات العدسية هو بروتوكول مدته خمسة أيام يبدأ بتقسيم خلايا HEC 2 93 T إلى 60 إلى 80٪ طلاقة مشتركة في قارورة مساحتها 162 سم مربع في وسط زراعة الخلايا. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي. قم بإعداد محلول تعداء الحمض النووي ومحلول تعلية البولي إيثيلين أمين أو PEI كما هو موضح في نص البروتوكول.

أضف محلول تعداء الحمض النووي إلى دوامة محلول PEI أو اقلبها عدة مرات واحتضن لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة. قم بتنقيط ملليلترين من DNA TRANSFECTION بالإضافة إلى محلول PEI على خلايا HEC 2 93 T واحتضانها لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية بعد أربع ساعات.

قم بتحديث وسيط الثقافة. لإزالة PEI ، احتضان الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في اليوم الرابع ، اجمع المادة الطافية في أنبوب سعة 50 ملليلترا. أضف وسيطا ثقافيا جديدا إلى الخلايا وأعد القارورة إلى الطرد المركزي للحاضنة ، المادة الطافية التي تم جمعها عند 500 جرام لمدة خمس دقائق.

لإزالة الخلايا الميتة ، استخدم حقنة كبيرة سعة 60 مليلتر لدفع SUPERNAT عبر مرشح 0.45 ميكرومتر. قم بتخزين السوفنات المفلترة طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي. اجمع أجهزة الطرد المركزي وقم بتصفية الدفعة الثانية من المواد الطافية كما هو موضح في الدفعة الأولى.

تجمع الدفعتين من المواد الطافية في أنابيب الطرد المركزي الفائقة. جهاز طرد مركزي عند 50 ، 000 GS لمدة 90 دقيقة. عند اكتمال الطرد المركزي ، بعناية فائقة ، قم بإزالة الكبسولات التي تحتوي على أنابيب الطرد المركزي الفائقة وضعها في غطاء التدفق الرقائقي.

افتح الكبسولة التي تحمل أنبوب الطرد المركزي الفائق وصب الوسط بعناية باستخدام الحبيبات الموجودة على الجانب العلوي من الأنبوب. من المهم أن تتذكر أي جانب من الأنبوب قد تشكل لأن الكريات الفيروسية قد يكون من الصعب تصورها. بعد ذلك ، استخدم ماصة صغيرة لإزالة الجزء الأخير من الوسط مع الحرص على عدم تحريك الحبيبات البنية غير الشفافة المرئية على جانب الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق.

أعد تعليق هذه الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط الثقافة العضوية المكملة بمثبطات النيكوتيناميد كيناز وإعادة الدماغ بولي يعد التعليق في هذا الوسط مهما لأنه سيتم استخدام فيروس العيار العالي مباشرة لنقل العضيات قبل يومين من التنبيغ. قسم بئر كامل بمساحة 0.95 سم مربع من العضيات إلى بئر جديد من صفيحة 48 بئر.

باتباع بروتوكول منشور مسبقا. تهدف إلى الحصول على ما يقرب من 50 عضوية صغيرة في الثقافة العضوية. متوسط مكمل بمثبط سينسيز كيناز الجليكوجين والنيكوتيناميد.

للحصول على الخبايا الكيسية المفرطة التكاثر. احتضان العضيات لمدة يومين في يوم نقل التنبيغ وحصاد العضيات باستخدام ماصة صغيرة P 1000. ماصة جل ماترا ومتوسطة لأعلى ولأسفل ، وبالتالي تعطيل الخليط.

ضع الخليط في أنبوب سعة 15 مل. قم بتعطيل الخليط بشكل أكبر باستخدام PEs ، الماصة الخاصة بك ، حيث تم تقليل الفتحة البعيدة عن طريق إذابة بيليه العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 100 Gs لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية عند 500 ميكرولتر من التدفئة المسبقة ، واحدة × التربسين ، وأعد تعليق العضيات ، واحتضانها لمدة ثلاث دقائق.

في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة 3.5 مل من أجهزة الطرد المركزي المتوسطة لثقافة خط الخلية لمدة خمس دقائق. عند 500 Gs.قم بإزالة السوبر ناتان لتترك الحبيبات في حوالي 20 ميكرولتر من المتوسط. انقل العضيات في هذه الكمية الصغيرة الأخيرة من الوسط إلى بئر.

على طبق 48 بئر. أضف فيروس العدسات عالي العيار المعد مسبقا في وسط التنبيغ إلى العضيات وأعد تعليقه. احتضان خليط الفيروس العضوي لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة استزراع للسماح بالنقل بعد ساعة واحدة ، أضف ملليلترا واحدا من الثقافة العضوية ، متوسطة إلى خليط الفيروس العضوي ، وأعد تعليقه ، وانقل الخليط إلى جهاز طرد مركزي أنبوب طرد مركزي دقيق عند 850 GS لمدة خمس دقائق.

لتكويب العضيات ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات. في 20 ميكرولترا من جل ماترا المثلج ، ضع القطرة في منتصف البئر. في طبق 48 بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

حتى تتصلب القطرة بعد 15 دقيقة. أضف بعناية 250 ميكرولتر من الثقافة العضوية. متوسط مكمل بمثبطات النيكوتيناميد والكيناز.

قم بتسخين كتلة الألمنيوم في حاضنة على حرارة 70 درجة مئوية للحفاظ على سائل البارافين. قم بإزالة الوسط من بئر واحد مع العضيات كاملة النمو مع ترك العضيات المضمنة سليمة وأضف ملليلترا واحدا من 4٪ ألدهيد Paraform في PBS مباشرة إلى البئر. استبدل الألدهيد الشكلي بمليلتر واحد من PBS.

أعد تعليق العضيات الثابتة في PBS وانقلها إلى قارورة زجاجية. دع العضيات تغرق في القاع لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بإخراج الماصة من PBS واستبدلها بنسبة 70٪ من الإيثانول الذي يتم فيه إذابة قطرتين من محلول eoin.

لتمكين تصور العضيات طوال عملية التضمين ، اترك العضيات في 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة 70٪ من الإيثانول عن طريق سحب العينة بعناية. يمكن تصور العضيات بالعين بسبب لون eoin الوردي.

استبدل محلول التضمين بنسبة 96٪ من الإيثانول واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بهذه الطريقة. بعد ذلك ، قم بتمرير العضيات من خلال 70٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 96٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول ، 100٪ إيثانول ، زيلين وزيلين. صب آخر غسول زيلين وصب البارافين في القارورة الزجاجية.

ضع القارورة على الفور في كتلة الألمنيوم الدافئة مسبقا على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، استبدل البارافين بالبارافين النظيف الجديد ب prewarm أو PE أو ماصة. اسكب البارافين واستخدم آفة أو ماصة دافئة بفتحة كبيرة لماصة العضيات في قالب كتلة البارافين في طبقة من البارافين السائل.

قم بتسخين إبرة تشريح باستخدام موقد بنسن وقم بمعالجة جميع العضيات قدر الإمكان باتجاه مركز قالب كتلة البارافين. عندما يكون توطين العضيات في القالب مرضيا ، قم بتبريد القالب قليلا لترسيخ طبقة البارافين. قم بإنهاء الكتلة عن طريق سكب المزيد من البارافين في الأعلى وإضافة كاسيت تضمين نسيجي قياسي.

في هذا البروتوكول ، تم نقل عضويات ظهارة الأمعاء مع فيروسات العدس. تنمو العضيات العادية كهياكل زغابية K crypt مع عدد من الخبايا التي تخرج من مجال الزغابات المشترك. عند معالجة هذه العضيات بمثبط GSK Three B ، CHIR 9 9 0 21 ، يزداد الانتشار وتصبح الخبايا كيسية بعد نقل العضوية.

باستخدام الإفراط في التعبير عن EGFP الفيروسي ، تعبر العضيات عن خطوات تعزيز نقل التنبيغ EGFP الفلورية التي يمكن إجراؤها عندما تكون فعالية التنبيغ منخفضة ، مثل التلقيح أو الحضانة الفيروسية لفترات طويلة غير مطلوبة ، لأن هذه الخطوات لن تزيد من الفعالية العالية بالفعل. بعد ذلك ، تتم معالجة هذه العضيات لتقنيات الحمض النووي الريبي والكيمياء المناعية. هذه الصورة التمثيلية عبارة عن قسم من العضوية المعوية للفأر ، ملطخة ب BRDU بعد الحضانة مع BRDU لمدة ساعة واحدة قبل التثبيت.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقل العضيات من ظهارة الأمعاء الأولية باستخدام جزيئات الفيروسات العدسية أو الفيروسات القهقرية.