باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل أنواع فردية من الخلايا العصبية من أنسجة الدماغ لإجراء تحليلات لاحقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تفكيك الأنسجة العصبية إلى معلق من الخلايا المفردة. وفي الخطوة الثانية، يتم إزالة الميالين من المعلق، ثم تُصبغ الخلايا باستخدام أجسام مضادة خاصة بأنواع معينة من الخلايا.

في الخطوة النهائية، يتم فرز المجموعات الخلوية الفردية بواسطة قياس التدفق الخلوي. وفي نهاية المطاف، ستسمح طريقة العزل المحددة لنوع الخلية هذه للمستخدمين بتقييم التغيرات في التعبير الجيني أو البروتيني أو التعديلات فوق الجينية بطريقة محددة لنوع الخلية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال العلوم العصبية، مثل تحديد أنواع الخلايا التي تعبر عن مستقبلات معينة، أو التي تعبر عن بروتينات معينة، أو التي تعبر عن تعديلات فوق جينية معينة، وذلك لتمكيننا من فهم الآليات المحددة لنوع الخلية في الدماغ بشكل أفضل.

ابدأ عملية التفكيك العصبي باستخدام شفرات حلاقة معقمة لتقطيع كل عينة تم جمعها من أنسجة الدماغ البالغة إلى قطع صغيرة تتراوح كتلتها بين 30 إلى 400 milligram على غطاء طبق زراعة مكون من ستة آبار. بعد ذلك، اغمر النسيج في 1 mL من محلول HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم، واستخدم ماصة لنقل العينات إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 2 mL بعد جمع كافة الأنسجة. قم بطرد العينات مركزياً ثم اسحب السوائل الطافية.

أضف 1,900 µL من الإنزيم الدافئ. اخلط المزيج واحضن العينات لمدة 15 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C، مع قلب الأنبوب عدة مرات كل خمس دقائق لإعادة تعليق قطع الأنسجة المترسبة.

في نهاية فترة الحضن، أضف 30 µL من الإنزيم المُحضّر حديثاً. اخلط العينات جيداً عن طريق قلب الأنابيب بلطف. ثم وباستخدام ماصة باست المحددة بالرقم واحد، قم بتفكيك كل عينة عن طريق السحب والدفع للأعلى والأسفل لـ 30 مرة.

مع الحرص على تجنب تكوين فقاعات. تُحضن العينات لمدة 15 دقيقة أخرى عند 37 degrees Celsius مع القلب كل خمس دقائق، يليه تفكيك العينات باستخدام ماصة بست رقم 2، كما تم توضيحه للتو.

بعد ذلك، انتقل إلى الماصة رقم ثلاثة، وكرر عملية الفصل وحضن العينات لمدة 10 دقائق إضافية في الحمام المائي مع القلب كل خمس دقائق. وفي نهاية فترة التحضين، قم بترشيح معلقات الخلايا المفردة عبر مصفاة خلايا بمسامية 80 micron في أنابيب Falcon سعة 15 milliliter. اغسل كل مصفاة بـ 10 milliliters من محلول HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم لإيقاف التفاعلات الإنزيمية. وعند الانتهاء من ترشيح العينة الأخيرة، قم بطرد مركزي للأنابيب وسحب الرواسب العلوية للتخلص من الميالين من الخلايا.

تُعاد تعليق الرواسب جيداً في 400 µL من محلول إزالة الميالين المنظم، وتُضاف الكمية المناسبة من حبيبات إزالة الميالين إلى كل أنبوب. يتم سحب المحاليل وطردها باستخدام الماصة عدة مرات حتى تختلط الخلايا والحبيبات تماماً. بعد ذلك، تُحضن العينة عند درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة.

بعد فترة الحضن، اغسل كل عينة في 5 mL من منظم إزالة الميالين (myelin removal buffer) أثناء دوران الخلايا، ثم ضع عموداً واحداً لكل عينة في المجال المغناطيسي لجهاز الفرز المغناطيسي، وضع مرشحاً نظيفاً بمسامية 80 ميكرون فوق كل عمود. اشطف كل مرشح وعمود بـ 1 mL من منظم إزالة الميالين ثلاث مرات، مع تجميع كافة السوائل المارة في حاوية نفايات. بعد الشطف النهائي، ضع أنابيب بوليسترين مستديرة القاع سعة 5 mL مباشرة أسفل كل عمود لتجميع السائل المستخلص.

بعد ذلك، يتم سحب السائل الطافي من العينات وإعادة تعليق الرواسب في 500 µL من محلول إزالة الميالين المنظم. يتم تطبيق معلقات الخلايا فوراً على الأعمدة، مع تجميع الخلايا في الأنابيب الموجودة أدناه. ثم يتم شطف كل مرشح وعمود أربع مرات باستخدام 1 mL من محلول إزالة الميالين المنظم لكل غسلة.

بعد عملية الغسل الأخيرة، قم بطرد الخلايا مركزياً ثم اسحب السوائل الطافية لصبغ الخلايا من أجل فرزها بواسطة قياس التدفق الخلوي. استخدم جهاز الفورتيكس (Vortex) لكل عينة لمدة ثانيتين تقريباً لتفكيك الرواسب، ثم انقل 1 µL من الخلايا من كل أنبوب إلى أنابيب منفصلة. بالنسبة لعينات ضبط الصبغ، أضف فوراً 5 µL من FC block إلى كل أنبوب، بما في ذلك أنابيب ضبط الصبغ.

بعد ذلك، قم برج العينات بجهاز الفورتيكس مرة أخرى واحضنها عند درجة حرارة 4 °C. وبعد خمس دقائق، أضف 100 µL من مزيج الأجسام المضادة الأولية المناسب. قم بتغطية الأنابيب لحماية الأجسام المضادة من الضوء، واحضن الخلايا عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة.

في نهاية فترة التحضين، اغسل العينات باستخدام 2 mL من محلول الغسيل المنظم، ثم اسحب السوائل الطافية وأضف إلى كل عينة 100 µL من الجسم المضاد الثانوي المناسب. غطِّ الأنابيب وضعها في درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، اغسل العينات باستخدام 2 mL من محلول الغسيل المنظم، ثم قم بطرد العينات مركزياً، وأخيراً اسحب السوائل الطافية.

إعادة تعليق الرواسب الطافية، يتم تعليق الكريات في 250 µL من محلول PBS المعقم وفرز الخلايا؛ تظهر هنا مجموعات نموذجية من الخلايا العصبية التي تم فرزها بتدفق خلوي من حصين ذكر واحد. تم تحديد بوابات الخلايا أولاً من جميع الأحداث الممكنة بناءً على خصائص التشتت الأمامي والجانبي. بعد ذلك، تم تحديد بوابات الخلايا المفردة (singlets) لتمييزها عن أي ثنائيات أو تجمعات خلوية أكبر بناءً على حجمها للسماح بفرز دقيق لأنواع الخلايا الفردية. ثم تم فرز الخلايا المفردة إلى مجموعات خلوية CD 11 B موجبة وCD 11 B سالبة، مع إجراء فرز إضافي للخلايا CD 11 B السالبة إلى خلايا GT one وموجبة TH one. استُخدم برنامج التحليل بعد ذلك لتحديد العدد الإجمالي للأحداث في كل مجموعة، بالإضافة إلى النسبة المئوية من المجموعات الأصلية للتأكد من نقاء الخلايا المفرزة.

في هذا المثال المحدد، تم تحليل التعبير الجيني النسبي لجينات محددة لأنواع خلايا بديلة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR). وكما كان متوقعاً، أكدت هذه البيانات نقاء الخلايا المفروزة، كما حددت بعض الاختلافات المثيرة للاهتمام عبر مناطق الدماغ التي خضعت للدراسة. وبعد التأكد من نقاء عملية الفرز، يمكن قياس تعبير الجينات الأخرى ذات الصلة لتحديد نوع الخلية المحدد الذي يتم التعبير فيها عنها، أو ما إذا كان تعبيرها قد تغير بعد العلاج بطريقة خاصة بنوع الخلية.

على سبيل المثال، تم هنا استقصاء تعبير cow binding، وهو بروتين رابط للكالسيوم يُستخدم غالباً لتحديد العصبونات في الحصين والمخيخ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية عزل أنواع معينة من الخلايا العصبية محل الاهتمام، مثل الخلية العصبية الموضحة هنا، باستخدام أجسام مضادة مناسبة لسطح الخلية.