الكمي الآلي للخلية المكونة للدم - التفاعلات خلية انسجة في صور النسيجية من Undecalcified العظام

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس الارتباطات بين مجموعات خلوية محددة في نخاع العظم. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع مقاطع تجميدية نسيجية من أورام عظام الفخذ للفئران. وفي الخطوة الثانية، يتم صبغ المقاطع لإجراء تحليل مناعي فلوري واكتساب صور مجهرية بؤرية.

بعد ذلك، يتم تحليل الصور رقميًا. وفي النهاية، يمكن محاكاة مواقع الأنواع المختلفة من الخلايا لحساب معدلات وتكرار الاتصال بين الخلايا المناعية المحددة محل الاهتمام وبيئتها الدقيقة. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحلل المنافذ البيئية الدقيقة للخلايا البلازمية طويلة العمر في نخاع العظم، وكنا بحاجة إلى طريقة لقياس الارتباطات الخلوية داخل نسيج نخاع العظم بشكل لا لبس فيه.

ستقوم المساعدة البحثية مايا بتوضيح إجراء القطع بالتجميد لعظام الفخذ من فأر بالغ. أولاً، اضبط درجة حرارة العينة والشفرة في ميكروتوم قياسي مجهز بشفرة للأنسجة الصلبة على -24 °C. بعد فترة تكيّف مدتها 15 دقيقة.

ثبّت كتلة العينة في حامل العينات المعدني باستخدام وسط التضمين بالتجميد، واضبط اتجاه الكتلة حسب الضرورة. قم بتقليم العينة حتى يفتح العظم بالكامل ويصبح النخاع مرئيًا. بعد ذلك، اضبط سمك المقطع على 7 microns.

بعد ذلك، قم بتثبيت قطعة من شريط كاواموتو اللاصق بحيث يكون الجانب اللاصق للأعلى على كتلة العينة باستخدام ملعقة خشبية مغطاة بالجلد. قم بتقطيع العينة وباستخدام الملقط، اقلب الشريط بحيث يكون المقطع موضعاً على الجانب العلوي. ثم انقل الشريط إلى شريحة مجهر زجاجية.

ثبّت الشريط على الشريحة الزجاجية باستخدام شريط لاصق بمجرد جمع المقطع الأخير. اترك العينات لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل، ثم خزن الشرائح في درجة حرارة -80 °C. يتم تصوير العينات وصب المقاطع المجمدة المذابة وفقاً لبروتوكولات التألق المناعي الشائعة.

مع التأكد من إدراج صبغة نووية لتصور سلامة النسيج. بعد صبغ المقاطع، أضف قطرة واحدة من وسيط التثبيت إلى كل عينة، ثم ضع غطاء شريحة زجاجي رقم 1، وذلك تحت مجهر ماسح متحد البؤر ليزري. اختر العدسة الشيئية 20x واضبط مجال الرؤية على 708.15 في 708.15 ميكرون.

بعد ذلك، قم بتصوير العينات واحدة تلو الأخرى بدقة 2048 في 2048 بكسل لكل صورة للحفاظ على إمكانية مقارنة النتائج. يتم تسجيل الصور في قناة واحدة لتصور البنى السدوية، وقناة واحدة للنوى، وقنوات إضافية للخلايا المكونة للدم ذات الاهتمام حسب الضرورة. سجل الصور باستخدام تقنية متوسط الخط (line averaging).

من الناحية المثالية، يتم التقاط صور مفردة متجاورة لتغطية المقطع الفخذي بالكامل. ثم تُحفظ الصور بتنسيق ملفات صور مجهرية. بعد ذلك، يتم تصدير ملف JPEG واحد لكل قناة لكل منطقة تم تصويرها، واستخدام أداة لتحليل الصور لإجراء قياس كمي لتجزئة الصور من أجل تحليل التوضع المشترك وتحليل الجوار قبل تنفيذ محاكاة الخلايا العشوائية.

تحديد الموضع على صور نخاع العظم التي تم تحليلها لكل صورة سيتم محاكاتها. ضع الملفات التالية في مجلد واحد: ملفات CSV الفردية التي وفرتها أداة اتصال الخلايا، وملفات JPEG الأصلية لقناة DPI، وملفات JPEG الأصلية للقناة السدوية (stromal channel) لإجراء عمليات محاكاة جماعية على سلسلة الصور المأخوذة من عينة فخذية واحدة، مع نقل جميع ملفات JPEG الأصلية وملفات CSV الفردية المقابلة لها إلى مجلد آخر في هذا الوقت أيضاً.

بمجرد تجميع كافة الملفات، ابدأ بتشغيل أداة المحاكاة. ثم قم بتفعيل مربع "التحميل التلقائي لبيانات الصور" (auto load image data). عند تحديد هذا الخيار، سيتم فتح ملفات CSV المقابلة للصور التي تم تحليلها تلقائياً.

بعد ذلك، أدخل الوسم المشترك لملفات CSV وعدد مجموعات الصور التي يجب استخدامها لمحاكاة وضع الدفعة (batch mode). ثم قم بتحميل ملف J peg الناتج عن قناة S stroma والذي ينتهي اسم الملف بالرقم ثلاثة لإنشاء القناع لقناة DPI. حدد مربع "تطبيق القناع" (apply mask) واضبط عتبة تحويل صورة DPI إلى قناع ثنائي على 10.

حدد المربعين "eight bit" و"dilate" واضبط درجة التوسيع (grade of dilation) على خمسة بكسل. ثم حدد مربع "width erosion". بعد ذلك، أدخل القيمة المطلوبة لنصف قطر الجوار (vicinity radius) المستخدم في تحليل الصور المحاكاة، وحدد مربع "use OSU" لاستخدام خوارزمية OSU للكشف التلقائي عن البنى السدوية (stromal structures) للخلايا المكونة للدم.

تتم محاكاتها كأشكال دائرية. قم بقياس توزيع حجم الخلايا لأنواع الخلايا التي تم تحليلها باستخدام أي برنامج لتحليل الصور يتضمن وظائف تقسيم الكائنات المناسبة، وحدد قيمة sigma لجميع الأنواع المكونة للدم من هذه القياسات. ويمكن تحديد حد قطع حجم الخلية، وهو القطر بالبكسل الذي يصف أصغر كائن لا يزال يتم التعرف عليه كخلية كاملة بواسطة أداة تحليل الصور.

ثم أدخل حد قطع حجم الخلية وقيمة sigma بالبكسل لمحاكاة توزيع حجم الخلايا لكل من الخلايا الحمراء والخضراء والزرقاء. بعد ذلك، في علامة تبويب الخلايا والقناع (cells and mask)، حدد مربع الحذف (delete) للسماح للبرنامج باختيار موضع جديد للخلية إذا كانت تتداخل مع بكسل واحد على الأقل ضمن منطقة محظورة في القناع. وتحت علامة تبويب استبعاد الخلايا (cell exclusion)، حدد أيضاً مربع تجنب تداخل الخلايا (avoid cell overlap).

بعد ذلك، أدخل الحد الأدنى المسموح به للمسافة بين مركزي خليتين بالبكسل. إذا كان التداخل مُحددًا بالمسافة الدنيا من مركز خلية واحدة إلى مركز خلية أخرى، فقم بتعيين الحد الأقصى لمساحة التداخل إلى 100% ثم اضبط أداة المحاكاة على 1000 تكرار. بعد ذلك، حدد مربع الحفظ التلقائي للمبيعات لحفظ إحداثيات الكائنات التي تمت محاكاتها لجميع تكرارات كل صورة في الدفعة كملفات مستخرجة بتنسيق نصي.

أدخل أيضاً وسماً شائعاً للملفات المحفوظة. وأخيراً، انقر فوق "تشغيل المحاكاة" (run simulation) لتحديد متوسط ترددات التلامس والمجاوَرَة لمجموعات مكونة من 1000 صورة محاكاة مقابلة لكل صورة مسجلة. ولهذا الغرض، اقسم متوسط أعداد التلامس والمجاوَرَة على عدد الخلايا المسجلة لكل صورة، وقارن هذه الترددات بنتائج تحليل التوطين المشترك الآلي للصورة المسجلة.

يُعرض في هذا الشكل تحليل موضعي للخلايا الحمضية، والخلايا البلازمية، والخلايا البائية مع البيئة الدقيقة للخلايا السدوية باستخدام نخاع عظمي خيمري فلوري. تحتوي ملفات CSV التي تم إنشاؤها بواسطة أدوات الاتصال والتقارب الخلوي على عدد الخلايا والمساحة الإجمالية لكل مجموعة خلوية بالبكسل، بالإضافة إلى أعداد الاتصال أو التقارب. وقبل إجراء محاكاة للتوزيع العشوائي للخلايا، يجب تحديد المعلمات التي تصف توزيع حجم الخلايا كتوزيع غاوسي في هذه المحاكاة، مع الحفاظ على القيم النسبية لـ sigma المقاسة للمجموعات الخلوية الثلاث.

بينما تم ضبط قيم Sigma المحددة بالبكسل لتتطابق مع المظهر المرئي للخلايا المسجلة لتحديد المناطق التي يمكن وضع الخلايا فيها، تم إنشاء قناع من قناة DAPI. ثم تم تحديد القيمة 10 كحد عتبة الكثافة الأمثل لإنشاء الصور الثنائية. بعد ذلك، تم اختبار مدى صلة تلامس الخلايا البلازمية، أو الخلايا الحمضية، أو الخلايا B مع الخلايا السدوية كما كان متوقعاً.

كشفت هذه التحليلات عن معدلات تلامس أعلى بشكل ملحوظ في الصور المسجلة مقارنة بالمحاكاة بالنسبة للخلايا البلازمية والخلايا B. وفي المقابل، لم يُلاحظ وجود فرق واضح في تلامس الخلايا الحمضية مع الخلايا السدوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في أي مجال يتطلب تحليل البنية النسيجية المعقدة لنخاع العظم، مثل علم المناعة، أو علم الدم، أو علم الأمراض، أو بيولوجيا الخلايا الجذعية.