الكمي الآلي للخلية المكونة للدم - التفاعلات خلية انسجة في صور النسيجية من Undecalcified العظام

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الارتباطات بين مجموعات فرعية معينة من الخلايا في نخاع العظام. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع أقسام التبريد النسيجية أولا من أورام عظم الفخذ في الفئران. في الخطوة الثانية ، يتم تلطيخ الأقسام لتحليل الفلورسنت المناعي ويتم الحصول على صور متحد البؤر.

ثم يتم تحليل الصور رقميا. في النهاية ، يمكن محاكاة مواضع أنواع الخلايا المختلفة لحساب معدلات وتواتر التلامس بين الخلايا المناعية المحددة ذات الأهمية وبيئتها الدقيقة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحلل المنافذ البيئية الدقيقة لخلايا البلازما طويلة العمر في نخاع العظام ، وكنا بحاجة إلى طريقة لتحديد الارتباطات الخلوية داخل أنسجة نخاع العظم بشكل لا لبس فيه.

سوف توضح RA Maya الإجراء لك لشفط عظام الفخذ بالتبريد من فأر بالغ. أولا ، قم بإعداد العينة ودرجة حرارة الشفرة لميكروتوم قياسي مزود بشفرة أنسجة صلبة إلى سالب 24 درجة مئوية. بعد 15 دقيقة من التأقلم.

قم بتثبيت كتلة عينة على حامل العينة المعدني باستخدام وسيط تضمين التبريد واضبط اتجاه الكتلة حسب الضرورة. قم بقص العينة حتى يتم فتح العظم بالكامل ويصبح النخاع مرئيا. ثم اضبط سمك القسم على سبعة ميكرون.

بعد ذلك ، قم بإصلاح قطعة من الشريط اللاصق kawamoto مع الجانب اللاصق في الجزء العلوي من كتلة العينة باستخدام ملعقة خشبية مغطاة بالجلد العزيز قسم العينة وباستخدام الملقط. أدر الشريط بحيث يتم وضع القسم على الجانب العلوي. ثم انقل الشريط إلى شريحة مجهر زجاجي.

ثبت الشريط على الشريحة الزجاجية بشريط سكوتش عند جمع القسم الأخير. دع العينات تسير لمدة 30 دقيقة على الأقل وقم بتخزين الشرائح عند سالب 80 درجة مئوية. تقوم امرأتان بتصوير العينات لتلطيخ أقسام التبريد المذابة وفقا لبروتوكولات التألق المناعي الشائعة.

تأكد من تضمين بقعة نووية لتصور سلامة الأنسجة. بعد تلطيخ الأقسام ، أضف قطرة واحدة من حامل الأرضية إلى كل عينة ، متبوعة بزلة غطاء زجاجي رقم واحد على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. حدد عدسة الهدف 20 × وقم بتعيين عرض مجال 708 نقطة 15 × 708 نقطة 15 ميكرون.

ثم قم بتصوير العينات واحدة تلو الأخرى بمعدل 2048 × 2048 بكسل لكل صورة للحفاظ على النتائج قابلة للمقارنة. تسجيل الصور في قناة واحدة لتصور الهياكل اللحمية ، وقناة واحدة للنوى وقنوات إضافية للخلايا المكونة للدم ذات الأهمية حسب الضرورة. سجل الصور باستخدام متوسط الخطوط.

الناحية المثالية التقاط صور متجاورة واحدة لتغطية قسم الفخذ بالكامل. ثم احفظ الصور بتنسيق ملف صورة مجهري. ثم قم بتصدير ملف JPEG واحد لكل قناة لكل منطقة تم تصويرها ، واستخدم أداة تحليل الصور لإجراء القياس الكمي لتجزئة الصورة للتحديد المشترك وتحليل الجوار قبل تنفيذ عمليات محاكاة الخلية العشوائية.

تحديد المواقع على صور نخاع العظم التي تم تحليلها لكل صورة ليتم محاكاتها. ضع الملفات التالية في مجلد واحد، ملفات CSV الفردية التي توفرها أداة اتصال الخلية. ملفات JPEG الأصلية لقناة DPI وملفات JPEG الأصلية للقناة اللحمية لإجراء عمليات محاكاة مجمعة على سلسلة الصور من عينة واحدة من الفخذ لنقل جميع ملفات JPEG الأصلية وملفات CSV الفردية المقابلة لها إلى مجلد آخر في هذا الوقت أيضا.

عند تجميع جميع الملفات ، ابدأ تشغيل أداة المحاكاة. ثم حدد مربع بيانات التحميل التلقائي للصورة. مع تحديد هذا الخيار ، يتم فتح ملفات CSV المقابلة للصور التي تم تحليلها تلقائيا.

بعد ذلك، أدخل العلامة الشائعة لملفات CSV وعدد مجموعات الصور التي يجب استخدامها لمحاكاة وضع الدفعات. ثم قم بتحميل ملف J peg الذي تم إنشاؤه من قناة S stroma باسم ملف ينتهي بثلاثة لإنشاء قناع لقناة DPI. حدد مربع تطبيق القناع وقم بتعيين الحد الأدنى لتحويل صورة DPI إلى قناع ثنائي إلى 10.

تحقق من مربعات البتات الثمانية والتوسيع واضبط درجة التمدد على خمسة بكسل. ثم تحقق من مربع تآكل العرض. ثم أدخل القيمة المطلوبة لنصف قطر الجوار المستخدم لتحليل الصور المحاكاة ، وحدد مربع استخدام OSU لاستخدام خوارزمية OSU للكشف التلقائي عن الهياكل اللحمية للخلايا المكونة للدم.

محاكاة كأشكال دائرية. قم بقياس توزيع حجم الخلية لأنواع الخلايا التي تم تحليلها باستخدام أي برنامج لتحليل الصور يتضمن وظائف تجزئة الكائنات المناسبة ، وحدد السيجما لجميع أنواع المكونة للدم من هذه القياسات. يمكن تحديد قطع حجم الخلية وهو القطر بالبكسل الذي يصف أصغر كائن لا يزال يتم التعرف عليه على أنه الخلية الكاملة بواسطة أداة تحليل الصورة.

ثم أدخل قطع حجم الخلية والسيجما بالبكسل لمحاكاة توزيع حجم الخلية للخلايا الحمراء والخضراء والزرقاء. بعد ذلك في علامة تبويب الخلايا والقناع ، حدد مربع الحذف للسماح للبرنامج باختيار موضع جديد لخلية إذا كانت تتداخل مع بكسل واحد على الأقل داخل منطقة محظورة من القناع. ضمن علامة التبويب استبعاد الخلية، حدد مربع تجنب تداخل الخلية أيضا.

ثم أدخل الحد الأدنى للمسافة المسموح بها بين مركزي خليتين بالبكسل. إذا تم تحديد التداخل من خلال الحد الأدنى للمسافة من مركز خلية إلى مركز أخرى ، فقم بتعيين الحد الأقصى لمساحة التداخل على 100٪ ثم اضبط أداة المحاكاة على 1000 تكرار. ثم حدد مربع المبيعات الحفظ التلقائي لحفظ إحداثيات الكائنات المحاكاة لجميع التكرارات لكل صورة من الدفعة كملفات محطمة بتنسيق نصي.

أدخل علامة مشتركة للملفات المحفوظة أيضا. أخيرا ، انقر فوق تشغيل المحاكاة وحدد متوسط ترددات التلامس والجوار لمجموعات من 1000 صورة محاكاة تتوافق مع كل صورة مسجلة. بالنسبة لهذا الفجوة ، يتم احتساب متوسط الاتصال والجوار حسب عدد الخلايا المسجلة لكل صورة ، ومقارنة الترددات بنتائج تحليل التحديد المشترك الآلي للصورة المسجلة.

في هذا الشكل ، يتم تقديم تحليل توطين لليوزينيات وخلايا البلازما والخلايا البائية مع البيئة المكروية للخلايا اللحمية مع نخاع العظم الخيمري الفلوري. تحتوي ملفات CSV التي تم إنشاؤها بواسطة أدوات جهة اتصال الخلية والجوار على عدد الخلايا والمساحة الإجمالية لكل مجموعة خلايا بالبكسل بالإضافة إلى عدد جهات الاتصال أو الجوار. قبل إجراء محاكاة لتحديد المواقع العشوائية للخلية ، يجب تحديد المعلمات التي تصف توزيع حجم الخلية على أنه توزيع غاوسي في هذه المحاكاة ، وتم الحفاظ على القيم النسبية للسيجما المقاسة لمجموعات الخلايا الثلاثة.

بينما تم تعيين قيم Sigma المحددة بالبكسل لمطابقة المظهر المرئي للخلايا المسجلة لتحديد المناطق التي يمكن وضع الخلايا فيها ، تم إنشاء قناع من قناة DAPI. ثم تم تحديد قيمة 10 لتكون عتبة الكثافة المثلى لتوليد الصور الثنائية. ثم تم اختبار أهمية ملامسات خلايا البلازما أو الحمضات أو الخلايا البائية مع الخلايا اللحمية كما هو متوقع.

كشف هذا التحليل عن معدلات اتصال أعلى بكثير في الصور المسجلة مقارنة بمحاكاة خلايا البلازما والخلايا البائية. في المقابل ، لم يلاحظ أي فرق واضح في ملامسة الخلايا اللحمية اليوزينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أي مجال يتطلب تحليل بنية الأنسجة المعقدة لنخاع العظام ، مثل علم المناعة أو أمراض الدم أو علم الأمراض أو بيولوجيا الخلايا الجذعية.