الكمي الآلي للخلية المكونة للدم - التفاعلات خلية انسجة في صور النسيجية من Undecalcified العظام
أبريل 8, 2015
يتم تقديم استراتيجية لتحليل البيانات النسيجية كميا في نخاع العظام. ينتج عن الفحص المجهري متحد البؤر للخلايا المصنفة بالفلورسنت في أقسام الأنسجة صور ثنائية الأبعاد ، والتي يتم تحليلها تلقائيا. تتم مقارنة تحليلات التوطين المشترك لأنواع الخلايا المختلفة بالبيانات من الصور المحاكاة ، مما يعطي معلومات كمية حول التفاعلات الخلوية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الارتباطات بين مجموعات فرعية معينة من الخلايا في نخاع العظام. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع أقسام التبريد النسيجية أولا من أورام عظم الفخذ في الفئران. في الخطوة الثانية ، يتم تلطيخ الأقسام لتحليل الفلورسنت المناعي ويتم الحصول على صور متحد البؤر.
ثم يتم تحليل الصور رقميا. في النهاية ، يمكن محاكاة مواضع أنواع الخلايا المختلفة لحساب معدلات وتواتر التلامس بين الخلايا المناعية المحددة ذات الأهمية وبيئتها الدقيقة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحلل المنافذ البيئية الدقيقة لخلايا البلازما طويلة العمر في نخاع العظام ، وكنا بحاجة إلى طريقة لتحديد الارتباطات الخلوية داخل أنسجة نخاع العظم بشكل لا لبس فيه.
سوف توضح RA Maya الإجراء لك لشفط عظام الفخذ بالتبريد من فأر بالغ. أولا ، قم بإعداد العينة ودرجة حرارة الشفرة لميكروتوم قياسي مزود بشفرة أنسجة صلبة إلى سالب 24 درجة مئوية. بعد 15 دقيقة من التأقلم.
قم بتثبيت كتلة عينة على حامل العينة المعدني باستخدام وسيط تضمين التبريد واضبط اتجاه الكتلة حسب الضرورة. قم بقص العينة حتى يتم فتح العظم بالكامل ويصبح النخاع مرئيا. ثم اضبط سمك القسم على سبعة ميكرون.
بعد ذلك ، قم بإصلاح قطعة من الشريط اللاصق kawamoto مع الجانب اللاصق في الجزء العلوي من كتلة العينة باستخدام ملعقة خشبية مغطاة بالجلد العزيز قسم العينة وباستخدام الملقط. أدر الشريط بحيث يتم وضع القسم على الجانب العلوي. ثم انقل الشريط إلى شريحة مجهر زجاجي.
ثبت الشريط على الشريحة الزجاجية بشريط سكوتش عند جمع القسم الأخير. دع العينات تسير لمدة 30 دقيقة على الأقل وقم بتخزين الشرائح عند سالب 80 درجة مئوية. تقوم امرأتان بتصوير العينات لتلطيخ أقسام التبريد المذابة وفقا لبروتوكولات التألق المناعي الشائعة.
تأكد من تضمين بقعة نووية لتصور سلامة الأنسجة. بعد تلطيخ الأقسام ، أضف قطرة واحدة من حامل الأرضية إلى كل عينة ، متبوعة بزلة غطاء زجاجي رقم واحد على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. حدد عدسة الهدف 20 × وقم بتعيين عرض مجال 708 نقطة 15 × 708 نقطة 15 ميكرون.
ثم قم بتصوير العينات واحدة تلو الأخرى بمعدل 2048 × 2048 بكسل لكل صورة للحفاظ على النتائج قابلة للمقارنة. تسجيل الصور في قناة واحدة لتصور الهياكل اللحمية ، وقناة واحدة للنوى وقنوات إضافية للخلايا المكونة للدم ذات الأهمية حسب الضرورة. سجل الصور باستخدام متوسط الخطوط.
منالناحية المثالية التقاط صور متجاورة واحدة لتغطية قسم الفخذ بالكامل. ثم احفظ الصور بتنسيق ملف صورة مجهري. ثم قم بتصدير ملف JPEG واحد لكل قناة لكل منطقة تم تصويرها ، واستخدم أداة تحليل الصور لإجراء القياس الكمي لتجزئة الصورة للتحديد المشترك وتحليل الجوار قبل تنفيذ عمليات محاكاة الخلية العشوائية.
تحديد المواقع على صور نخاع العظم التي تم تحليلها لكل صورة ليتم محاكاتها. ضع الملفات التالية في مجلد واحد، ملفات CSV الفردية التي توفرها أداة اتصال الخلية. ملفات JPEG الأصلية لقناة DPI وملفات JPEG الأصلية للقناة اللحمية لإجراء عمليات محاكاة مجمعة على سلسلة الصور من عينة واحدة من الفخذ لنقل جميع ملفات JPEG الأصلية وملفات CSV الفردية المقابلة لها إلى مجلد آخر في هذا الوقت أيضا.
عند تجميع جميع الملفات ، ابدأ تشغيل أداة المحاكاة. ثم حدد مربع بيانات التحميل التلقائي للصورة. مع تحديد هذا الخيار ، يتم فتح ملفات CSV المقابلة للصور التي تم تحليلها تلقائيا.
بعد ذلك، أدخل العلامة الشائعة لملفات CSV وعدد مجموعات الصور التي يجب استخدامها لمحاكاة وضع الدفعات. ثم قم بتحميل ملف J peg الذي تم إنشاؤه من قناة S stroma باسم ملف ينتهي بثلاثة لإنشاء قناع لقناة DPI. حدد مربع تطبيق القناع وقم بتعيين الحد الأدنى لتحويل صورة DPI إلى قناع ثنائي إلى 10.
تحقق من مربعات البتات الثمانية والتوسيع واضبط درجة التمدد على خمسة بكسل. ثم تحقق من مربع تآكل العرض. ثم أدخل القيمة المطلوبة لنصف قطر الجوار المستخدم لتحليل الصور المحاكاة ، وحدد مربع استخدام OSU لاستخدام خوارزمية OSU للكشف التلقائي عن الهياكل اللحمية للخلايا المكونة للدم.
محاكاة كأشكال دائرية. قم بقياس توزيع حجم الخلية لأنواع الخلايا التي تم تحليلها باستخدام أي برنامج لتحليل الصور يتضمن وظائف تجزئة الكائنات المناسبة ، وحدد السيجما لجميع أنواع المكونة للدم من هذه القياسات. يمكن تحديد قطع حجم الخلية وهو القطر بالبكسل الذي يصف أصغر كائن لا يزال يتم التعرف عليه على أنه الخلية الكاملة بواسطة أداة تحليل الصورة.
ثم أدخل قطع حجم الخلية والسيجما بالبكسل لمحاكاة توزيع حجم الخلية للخلايا الحمراء والخضراء والزرقاء. بعد ذلك في علامة تبويب الخلايا والقناع ، حدد مربع الحذف للسماح للبرنامج باختيار موضع جديد لخلية إذا كانت تتداخل مع بكسل واحد على الأقل داخل منطقة محظورة من القناع. ضمن علامة التبويب استبعاد الخلية، حدد مربع تجنب تداخل الخلية أيضا.
ثم أدخل الحد الأدنى للمسافة المسموح بها بين مركزي خليتين بالبكسل. إذا تم تحديد التداخل من خلال الحد الأدنى للمسافة من مركز خلية إلى مركز أخرى ، فقم بتعيين الحد الأقصى لمساحة التداخل على 100٪ ثم اضبط أداة المحاكاة على 1000 تكرار. ثم حدد مربع المبيعات الحفظ التلقائي لحفظ إحداثيات الكائنات المحاكاة لجميع التكرارات لكل صورة من الدفعة كملفات محطمة بتنسيق نصي.
أدخل علامة مشتركة للملفات المحفوظة أيضا. أخيرا ، انقر فوق تشغيل المحاكاة وحدد متوسط ترددات التلامس والجوار لمجموعات من 1000 صورة محاكاة تتوافق مع كل صورة مسجلة. بالنسبة لهذا الفجوة ، يتم احتساب متوسط الاتصال والجوار حسب عدد الخلايا المسجلة لكل صورة ، ومقارنة الترددات بنتائج تحليل التحديد المشترك الآلي للصورة المسجلة.
في هذا الشكل ، يتم تقديم تحليل توطين لليوزينيات وخلايا البلازما والخلايا البائية مع البيئة المكروية للخلايا اللحمية مع نخاع العظم الخيمري الفلوري. تحتوي ملفات CSV التي تم إنشاؤها بواسطة أدوات جهة اتصال الخلية والجوار على عدد الخلايا والمساحة الإجمالية لكل مجموعة خلايا بالبكسل بالإضافة إلى عدد جهات الاتصال أو الجوار. قبل إجراء محاكاة لتحديد المواقع العشوائية للخلية ، يجب تحديد المعلمات التي تصف توزيع حجم الخلية على أنه توزيع غاوسي في هذه المحاكاة ، وتم الحفاظ على القيم النسبية للسيجما المقاسة لمجموعات الخلايا الثلاثة.
بينما تم تعيين قيم Sigma المحددة بالبكسل لمطابقة المظهر المرئي للخلايا المسجلة لتحديد المناطق التي يمكن وضع الخلايا فيها ، تم إنشاء قناع من قناة DAPI. ثم تم تحديد قيمة 10 لتكون عتبة الكثافة المثلى لتوليد الصور الثنائية. ثم تم اختبار أهمية ملامسات خلايا البلازما أو الحمضات أو الخلايا البائية مع الخلايا اللحمية كما هو متوقع.
كشف هذا التحليل عن معدلات اتصال أعلى بكثير في الصور المسجلة مقارنة بمحاكاة خلايا البلازما والخلايا البائية. في المقابل ، لم يلاحظ أي فرق واضح في ملامسة الخلايا اللحمية اليوزينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أي مجال يتطلب تحليل بنية الأنسجة المعقدة لنخاع العظام ، مثل علم المناعة أو أمراض الدم أو علم الأمراض أو بيولوجيا الخلايا الجذعية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لتحليل البيانات النسيجية بشكل كمي في نخاع العظام باستخدام المجهر المجسم. تتضمن التقنية صبغ أقسام الأنسجة وتحليل الصور الناتجة رقميًا لتقييم التفاعلات الخلوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الأنسجة
الخلفية
- فهم التفاعلات الخلوية في نخاع العظام أمر بالغ الأهمية للبحث المناعي.
- تُستخدم أقسام التبريد النسيجية لتصور أنواع مختلفة من الخلايا.
- يسمح المجهر المجسم بالتصوير المفصل للخلايا المصبغة.
- التحليل الكمي لهذه التفاعلات يمكن أن يوفر رؤى حول الاستجابات المناعية.
هدف الدراسة
- لتقييم الارتباطات بين مجموعات خلوية معينة في نخاع العظام.
- لتطوير طريقة لتحديد الكمي للارتباطات الخلوية بشكل لا لبس فيه.
- لمحاكاة مواضع الخلايا لحساب معدلات التلامس بين الخلايا المناعية.
الطرق المستخدمة
- جمع أقسام التبريد النسيجية من عظم الفخذ للفئران.
- صبغة الأقسام لتحليل المناعة الفلوري.
- اكتساب الصور المجسمة للتحليل.
- التحليل الرقمي لتحديد التفاعلات الخلوية وارتباطات البيئة المكروية.
النتائج الرئيسية
- الكمي الناجح للارتباطات الخلوية في نخاع العظام.
- تحديد معدلات التلامس بين الخلايا المناعية المحددة.
- توثيق الطريقة من خلال المقارنات مع الصور المحاكية.
- رؤى حول الأماكن البيئية المكروية للخلايا البلازمية طويلة العمر.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة المطورة نهجًا قويًا لتحليل التفاعلات الخلوية.
- يمكن للبيانات الكمية تعزيز فهم ديناميكيات الخلايا المناعية.
- يمكن تطبيق هذه التقنية على دراسات مختلفة تشمل نخاع العظام والاستجابات المناعية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Quantifying cellular co-localization in bone marrow addresses a critical challenge in immunology and hematology research: distinguishing true biological associations from random cell positioning. This method provides reproducible, quantitative analysis of hematopoietic-stromal interactions, reducing rater-dependent bias and enhancing interrater reliability. The approach supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery by enabling data-driven assessment of cellular microenvironment dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying direct contacts between hematopoietic and stromal cells in complex tissues.
- Operational Value: Provides unbiased measurement of cellular associations, reducing variability from manual counting and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing preferential cell associations from random co-localization through statistical simulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized quantitative outputs (contact and vicinity frequencies) for hematopoietic cell subsets within the bone marrow microenvironment.
- Operational Value: Enables high-resolution image acquisition and digital analysis workflows compatible with confocal microscopy platforms.
- Scalability: Facilitates batch processing of multiple femoral sections via automated simulation tools for consistent data generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase cellular interaction data to preclinical validation by characterizing microenvironmental niches for long-lived plasma cells and other immune subsets.
- Mechanistic De-risking: Uses simulation tools to test whether observed co-localization reflects biological preference versus random positioning, strengthening target confidence.
- Disease-Relevant System: Applicable to studies in immunology, hematology, pathology, and stem cell biology where bone marrow microenvironment analysis is critical.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, supporting hypothesis testing and biological de-risking in hematopoietic and stromal cell interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying cellular associations and microenvironmental context in bone marrow tissues.
- Screening: Enables assay readiness through standardized image acquisition, segmentation, and colocalization quantification workflows.
- Analytics: Delivers quantitative readouts (contact rates, vicinity frequencies) and simulation-based statistical comparison to assess biological significance.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by characterizing cellular niches relevant to immune cell function and persistence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for quantitative histological analysis across multiple bone marrow studies and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing objective, simulation-backed quantification of cellular interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated image analysis and batch simulation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in cellular association data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitatively validated microenvironmental interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy, and digital image analysis for hematopoietic and stromal cell detection.
- Dependent on laser scanning confocal microscopy with appropriate objectives and line averaging for comparable image acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of image file formats, CSV data handling, and simulation tool parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types and tissue sections, including cell size cutoff and sigma determination for accurate simulation.
- Practical limitation: Simulation accuracy depends on precise measurement of cell size distribution and mask generation from DAPI channel for stromal structure definition.
