منهج في اختيار الأبتامرات تبديل الهيكل تطبيقها على اللونية الذهب جسيمات متناهية الصغر الفحص
February 28th, 2015
يتم توفير بروتوكول لتحديد أجهزة تبديل الهيكل لأهداف الجزيئات الصغيرة بناء على طريقة اختيار حبة مغناطيسية صارمة قابلة للضبط. تعتبر Aptamers المختارة بخصائص تبديل الهيكل مفيدة للمقايسات التي تتطلب تغييرا توافقيا للإشارة إلى وجود هدف ، مثل مقايسة الجسيمات النانوية الذهبية الموصوفة.
الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء هيكل تبديل apti للتكامل كعناصر التعرف على منصات الكشف التي تعمل عن طريق الإشارة إلى تغيير في تأكيد aptamer عند ربط الهدف. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة مسبار التقاط بيوتينيل ومكتبة حمض نووي تكميلية للحبات المغناطيسية المطلية بالبكتيريا العقدية لشل حركة مكتبة الحمض النووي على سطح الخرزة. بعد ذلك ، يتم تطبيق مغناطيس على المحلول لتقسيم تسلسلات الربط من التسلسلات غير الملزمة المتبقية على الخرز.
ثم يتم تنقية التسلسلات المحتفظ بها وتضخيمها للجولة التالية من الاختيار. بعد بضع جولات من التحديد، تتم إضافة خطوة تحديد سلبية إلى العملية. بعد عدة جولات من الاختيار ، يوضح aptr المحدد تغييرا هيكليا عند ربط الهدف بناء على مقايسة الكشف عن هدف الجسيمات النانوية الذهبية.
ميزة هذه التقنية على التقنيات الحالية مثل الخلية X القائمة على المحلول ، هي أننا لسنا مضطرين إلى شل حركة الهدف إلى دعم قوي. لذا فإن الآثار المترتبة على هذه التقنية هي في تقييم مخاطر الحالة الفسيولوجية للفرد ، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن الكورتيزول هو مؤشر على الإجهاد ، والذي يمكن أن يؤدي إلى تقييم المشكلات الصحية. استخدم دائما حلول الحمض النووي المعدة حديثا لهذا البروتوكول ، خاصة للهدف والتحكم.
يتطلب تحضير الحمض النووي اهتماما خاصا. انقل 100 ميكرولتر من مكتبة الحمض النووي إلى أنبوب تدوير حراري وقم بتسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في خلاط حراري. ثم انقل الأنبوب إلى الجليد حتى تكون هناك حاجة إليه قبل استخدام هذا الحمض النووي ، حدد تركيزه الدقيق على مقياس الطيف الضوئي.
بعد ذلك ، قم بإعداد الخرز المغناطيسي ، والخرز المغناطيسي المشفر بالدوامة ، ونقل 400 ميكرولتر منها إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد. ضع هذا الأنبوب على المغناطيس لمدة دقيقتين وقم بإزالة المادة الطافية ، ثم اغسل الخرز. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم وقم بدوامها لإكمال الغسيل.
استخدم مغناطيسا لفصل الخرزات والتخلص من المادة الطافية. كرر عملية الغسيل هذه ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بتثبيت مسبار الالتقاط على الخرز المغناطيسي.
ابدأ بتعليق Resus للحبات و 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط باستخدام مسبار التقاط 50 ميكرومولار. ثم احتضن الخرزات لمدة 10 دقائق مع تحريك لطيف في درجة حرارة الغرفة. لإزالة مسبار الالتقاط الحر ، اغسل الخرزات ثلاث مرات أخرى كما كان من قبل ، باستخدام 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط لكل غسلة.
بعد الغسلات الثلاث ، أضف 400 ميكرولتر أخرى من المخزن المؤقت واجمع 100 ميكرولتر من محلول الخرز للخطوات المتبقية مع حفظ الباقي عند أربع درجات مئوية. يمكن استخدام الباقي لجولات الاختيار اللاحقة لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. عندما تكون هناك حاجة إلى المزيد من الخرزات ، يمكن تحضيرها بمجسات أطول لزيادة الصرامة في مخطط الاختيار هذا.
على سبيل المثال ، تم استخدام مجسات أطول بعد الجولة 13 ، وعند هذه النقطة تم تحقيق تخصيب كبير باستخدام صرامة أخرى. عند استخدام الخرز المأخوذ من التخزين ، ابدأ بغسل الكمية العاملة مرتين ، باستخدام 200 ميكرولتر من مخزن الربط لكل غسلة. خلاف ذلك ، فإن الخرز الطازج نظيف بالفعل.
أضف الآن 100 ميكرولتر من الحمض النووي البارد المفاجئ إلى الخرز واحتضنها لمدة نصف ساعة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض لطيف. بعد الحضانة ، اعزل الخرزات قبل التخلص من المادة الطافية. احسب تركيز الحمض النووي الذي يحتوي عليه لتحديد مقدار الحمض النووي المرتبط بالخرز.
بعد ذلك ، اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم. دع المخزن المؤقت الملزم يغسل الخرزات بتحريك لطيف لمدة خمس دقائق في كل مرة. ثم قم بإعداد الجزيء المستهدف في مخزن مؤقت ملزم عند 100 ميكرومولار وأعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من هذا المستحضر ، الجزيء المستهدف.
في هذه الحالة ، عادة ما يكون الكورتيزول شديد التركيز في الجولة الأولى من الاختيار. احتضان الخرزات مع الهدف لمدة نصف ساعة مع تحريك لطيف في الظروف المحيطة. بعد الحضانة ، احفظ snat الذي يحتوي على التسلسلات الملمحة للهدف.
بعد كل جولة أخرى من التخصيب ، خذ عينة من المادة الطافية النهائية لمراقبة العملية للمراقبة. قم بإزالة الكورتيزول من المادة الطافية عن طريق غسيل الكلى. يمكن تخطي ذلك إذا كان الجزيء المستهدف لا يتداخل مع قياس امتصاص الحمض النووي عند 260 نانومتر بعد كل جولة ، وتضخيم الحمض النووي المرتبط المستهدف بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام المادة الطافية التي تم جمعها من خطوة الاختيار الإيجابي كقالب.
مبدئيا دائما قم بإجراء اختبار PCR صغير لتحديد العدد الأمثل للتضخيم. خذ عينات 10 ميكرولتر بعد كل دورة وقارن العينات بسلم 25 زوجا أساسيا. هنا ، يجب أن تعمل المكتبة في 85 زوجا أساسيا على المنتجات المضخمة التي يتم رؤيتها بعد الدورة العاشرة ، لذلك يجب استخدام دورات أقل.
يمكن أن تختلف هذه النتيجة من جولة إلى أخرى ، لذلك من الضروري دائما إجراء الاختبار. ثم قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على نطاق واسع باستخدام العدد المحدد من الدورات باستخدام ثمانية أنابيب شريطية. قم بتضخيم ستة إلى ثمانية ملليلتر من خليط التفاعل للحصول على الكمية المطلوبة من الأمبليكون للجولة التالية من الاختيار ، والتي تتراوح بين واحد و 2.5 نانومول من الحمض النووي.
تحقق مرة أخرى من عينة من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مادة هلامية. ثم قم بتحويل الجزء الأكبر من المنتجات إلى حمض نووي أحادي تقطعت به السبل باستخدام حبات مطلية غير مغناطيسية. قم بتحميل 300 ميكرولتر من الخرز في عمود صغير محجوبه فريتز.
ثم باستخدام حقنة قفل إغراء ، اغسل الخرزات برفق بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت الملزم. عند تغيير المحلول لغسل العمود ، قم بإزالة المحقنة من العمود وإزالة المكبس من المحقنة. هذا يمنع الإزعاج غير الضروري للخرز.
قم بإنشاء وغسل أعمدة حبة كافية لمليلتر واحد من منتج PCR لكل عمود. مرر منتج PCR عبر الأعمدة باستخدام ضغط لطيف. سيتم الاحتفاظ بمنتجات الحمض النووي بواسطة الخرزات المرفقة بخيولها المضادة للحساس.
ثم اغسل الأعمدة المرتبطة بالحمض النووي بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت الملزم لإزالة جميع مكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مع ترك الحمض النووي لتجمع الربط فقط لإزالة تهجين الحمض النووي من العمود إضافة 0.5 مل من 0.2 مولي هيدروكسيد الصوديوم. ثم قم بتحلية الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل في الإيت باستخدام عمود تحلية محضر بالماء الخالي من النوكلياز. تخلص من 0.5 مل من التدفق الأولي من خلاله.
ثم مرر ملليلترا واحدا من الماء الخالي من النوكلياز عبر العمود لجمع الحمض النووي المحلى. قم بقياس امتصاص الحمض النووي الذي تم جمعه وإعداده للجولة التالية من الاختيار. كما هو موضح في بروتوكول النص ، تتم الآن إضافة الحمض النووي أحادي الشريطة الذي تم جمعه مرة أخرى إلى مجموعة من الخرزات المعدة حديثا المحضرة باستخدام مسبار الالتقاط.
الجولة الثانية من الاختيار مماثلة للجولة الأولى مع استخدام تركيز أقل من الكورتيزول. ومع ذلك ، بدءا من الجولة الثالثة ، قم بتضمين خطوة اختيار سلبية قبل الاختيار الإيجابي. بالنسبة للجولة الأولى من الاختيار السلبي ، أضف 200 ميكرولتر من هرمون البروجسترون الميكرومولار في مخزن مؤقت ملزم بالخرز.
إنه مشابه من الناحية الهيكلية ولكنه يختلف عن الكورتيزول. في الجولات اللاحقة ، قم بزيادة تركيز هرمون البروجسترون بعد رج الخليط برفق لمدة نصف ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبينات واغسل الخرزات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.
ثم تابع الاختيار الإيجابي. كما هو موضح سابقا مع تقدم الجولات ، اختلف تركيز الركيزة للتأثير على صرامة عملية الاختيار. تتم مناقشة التفاصيل في بروتوكول النص.
بعد ذلك ، اتبع بروتوكول النص لإجراء فحص الجسيمات النانوية الذهبية للكشف عن الكورتيزول. تعتمد هذه القراءة السريعة والمباشرة لقياس الألوان على التغيير الهيكلي للأبتامر عند ربط الهدف. وبالتالي ، فإنه يوفر مقياسا لتقييم قدرة الطريقة على تحديد abers بخصائص تبديل الهيكل.
ميزة أخرى لمقايسة الجسيمات النانوية الذهبية هي أنه يضخم إشارة بحيث يمكن اكتشاف أبتامر تقارب ميكرومولار شائع في الجزيئات الصغيرة عند مستويات ، أوامر من حيث الحجم أقل من ثابت التفكك. تم استخدام بروتوكول الاختيار التالي لعزل الأبرز الخاص بالكورتيزول. تم استخدام غسيل الكلى ومراقبة التخصيب لإظهار زيادة شطف الجزيء المستهدف بعد خطوات الاختيار اللاحقة.
لوحظ انخفاض في الشطف عند استخدام جزيء مستهدف أقل ومجسات التقاط أطول في الخطوات النهائية. تم استخدام تسلسل الجيل التالي لتحليل الحمض النووي المراوغ بعد عدة جولات مختلفة. في وقت مبكر بعد الجولة السادسة من الاختيار ، زادت نسبة منخفضة من التسلسلات من عدد النسخ ، والذي تم تصنيفه في 20 صندوقا بعد 13 جولة.
كانت نسبة أكبر بكثير من الحشرات في عدد كبير من النسخ. ثم عن طريق جعل عملية الاختيار أكثر صرامة. في الجولتين 14 و 15 ، كان ما يقرب من نصف الأرقام المختارة في المرتبة الأولى من تكرار رقم النسخ.
كان هناك حوالي 3000 تسلسل فريد في 30،000 جولة في هذه المرحلة. تم تحضين AP المختار بجسيمات الذهب النانوية متبوعة بإضافة الهدف أو لركائز التحكم في المقارنة. أظهر هذا الاختبار أن AP كان لديه خصوصية أكبر للكورتيزول من حمض المغص أو أثناء محاولة هذا الإجراء.
من المهم التحكم في صرامة الاختيار في كل جولة بالإضافة إلى تحسين عدد دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد بنية تبديل نقطة الوصول وإجراء فحص الكشف عن الجسيمات النانوية الذهبية.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لاختيار ابتامير يغير البنية لهدفه من الجزيئات الصغيرة باستخدام طريقة اختيار الخرزات المغناطيسية. تظهر الابتاميرات المختارة تغييرات في البنية عند الارتباط بالهدف، مما يعود بالنفع على اختبارات الكشف.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- البيولوجيا الجزيئية
- الكيمياء التحليلية
الخلفية
- الابتاميرات هي جزيئات DNA أو RNA قصيرة وحيدة الشريطة يمكنها الارتباط بأهداف محددة.
- تقوم الابتاميرات التي تغير البنية بالتغيير في البنية عند الارتباط بالهدف، مما يعزز قدرات الكشف.
- تستخدم مقايسات الجسيمات النانوية الذهبية هذه التغيرات في البنية للإشارة.
- تتيح هذه الطريقة الكشف عن الجزيئات الصغيرة دون تثبيت الهدف.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول لاختيار الابتاميرات التي تغير البنية.
- تحسين طرق الكشف عن الجزيئات الصغيرة مثل الكورتيزول.
- تقييم الحالات الفسيولوجية بناءً على مؤشرات الإجهاد.
الطرق المستخدمة
- يتم استخدام مسبار التقاط مرتبط بالبيوتين ومكتبة DNA مكملة مع الخرزات المغناطيسية.
- يتم استخدام الفصل المغناطيسي لفصل تسلسلات الارتباط عن التسلسلات غير المرتبطة.
- يتم إجراء عدة جولات من الاختيار والتضخيم لإثراء الابتاميرات المطلوبة.
- تستخدم مقايسات الجسيمات النانوية الذهبية لإظهار وظيفة الابتاميرات.
النتائج الرئيسية
- اختيار ناجح للابتاميرات التي تظهر تغييرات في البنية عند الارتباط بالهدف.
- ثبتت فعاليتها في الكشف عن الكورتيزول كمؤشر للإجهاد.
- يتيح البروتوكول استخدام محاليل DNA المعدة حديثًا للحصول على أفضل النتائج.
- يتحسن إثراء الابتاميرات مع استخدام مسبار أطول وزيادة الدقة.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لاختيار الابتاميرات التي تغير البنية.
- يمكن لهذه الابتاميرات تعزيز حساسية المقايسات لكشف الجزيئات الصغيرة.
- يمتلك هذا النهج تطبيقات محتملة في تقييمات الصحة المتعلقة بالإجهاد.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables the selection of structure-switching aptamers for small molecule targets without target immobilization, supporting biosensor development for physiological biomarkers. The approach enhances predictive confidence in target validation by enriching aptamers that undergo conformational change upon binding, reducing false positives from non-specific bead interactions. It provides a reusable discovery workflow for assay development in early-stage drug discovery, particularly for targets like cortisol where rapid, colorimetric readout is valuable for decentralized testing. The protocol’s emphasis on negative selection and probe length extension improves stringency, aiding in lead identification by minimizing background sequences and enriching high-affinity binders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting aptamers that undergo target-induced conformational change, providing functional validation of binding specificity.
- Operational Value: Eliminates need for target immobilization, simplifying workflow and reducing artifacts from surface-based interactions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by enriching sequences with demonstrable structural switching, increasing confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates aptamers compatible with gold nanoparticle assays, enabling quantitative, colorimetric readout for high-throughput screening.
- Operational Value: Produces standardized binding pools through repeated selection and amplification, improving assay reproducibility across runs.
- Scalability: Extended capture probe length after enrichment increases stringency, supporting reuse of the selection platform for multiple targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Selected aptamers demonstrate detection capability in buffer, providing a foundation for extension to physiological fluids like saliva or sweat.
- Biomarker Alignment: Cortisol detection aligns with stress-related biomarker monitoring, relevant for assessing physiological state in preclinical safety studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enrichment monitoring via elution and sequencing allows go/no-go decisions based on aptamer specificity and copy number frequency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from aptamer selection to functional assay development for small molecule detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating aptamers that reflect target-induced structural changes, clarifying binding mechanism and specificity.
- Screening: Delivers assay-ready aptamers with demonstrated performance in colorimetric formats, enabling reliable compound or ligand evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs via gold nanoparticle signal shift, allowing comparison of binding conditions and enrichment progress.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through buffer-based proof-of-principle data, informing future adaptation to complex matrices.
- Enterprise Reuse: Magnetic bead selection with modifiable probe length creates a reusable platform for multiple small molecule targets, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by selecting aptamers with verifiable conformational switching, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through negative selection steps and defined washing protocols, minimizing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by enabling early assessment of aptamer functionality, reducing investment in non-viable candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through enrichment tracking and sequencing data, informing advancement based on copy number dominance and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, magnetic bead separation, and PCR optimization to avoid amplification bias.
- Dependent on magnetic separation equipment, thermocyclers, and spectrophotometry for DNA quantification and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of binding buffer conditions and negative selection compounds (e.g., progesterone) to ensure reproducibility.
- Adaptation to physiological fluids may require optimization of salt concentration and temperature to maintain aptamer stability and target binding.
- Practical limitation: Partitioning efficiency is constrained by keeping melting temperature near room temperature, necessitating multiple selection rounds to reduce background.
