تقنية وقت التفاضلية تلطيخ جانب كامل الثنائي جيل إزالة التعصيب لدراسة Ionocytes في السمك

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في تكاثر الخلايا العضدية في خياشيم الأسماك الذهبية ، التي تفتقر إلى التعصيب الخارجي. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع الأسماك أولا في حمام صبغة خاص بالميتوكوندريا لتلطيخ الميتوكوندريا الموجودة مسبقا ، والخلايا العضدية الغنية. الخطوة الثانية هي إجراء إزالة التعصيب الثنائية الكاملة للخياشيم.

بعد ذلك ، يتم القتل الرحيم للأسماك. يتم حصاد الخياشيم. يتم تصنيف الخلايا باستخدام جسم مضاد ضد بوتاسيوم الصوديوم في TPAs.

ثم تتمثل الخطوة الأخيرة في تصوير وحساب الخلايا الموجودة مسبقا والمتمايزة حديثا. في النهاية ، هذه المرة يتم استخدام تقنية التلوين التفاضلي مع إزالة التعصيب الثنائي للنقابة لإظهار تكاثر وتوزيع الخلايا الخيشومية في الأسماك الذهبية دون أي مدخلات عصبية من الجهاز العصبي المركزي. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لفهم الامتصاص الديناميكي للأيونات وفحص إعادة توزيع الخلايا في ظهارة الجهاز الهضمي للأسماك.

أولا ، قم بإعداد محلول مخزون أحمر من المليمولار عن طريق إذابة 50 ميكروغراما في 94 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، والحماية من الضوء. بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاثة إلى ستة صناديق داكنة بحجم أقصى 600 ملليلتر. املأ كل صندوق ب 400 مل من ماء النظام وضع حجر هوائي في كل منها لتوفير مصدر للأكسجين.

ضع السمكة الذهبية التي تزن 30 إلى 40 جراما في الصناديق. بعد 30 دقيقة ، أضف محلول تعقب Mitre للحصول على تركيز كامل من 0.1 صبغة ميكرومولار و 0.01٪ DMSO. استحم السمك لمدة أربع ساعات.

بعد أربع ساعات ، قم بتشغيل تدفق المياه إلى الصناديق واترك الصبغة تتدفق. إذا كانت هذه تحكم ، فاسترجع الأسماك لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام ، ثم انتقل إلى الكيمياء المناعية ، وإلا انتقل إلى إجراء إزالة التعصيب الثنائي الكامل. أولا ، قم بتخدير الأسماك عن طريق وضع الأسماك في حمام مائي للبنزوكائين الهواء.

بمجرد توقف التنفس ، ضع السمكة على طاولة الجراحة وأدخل أنبوبا في تجويف الخد لري الخياشيم بمحلول مخدر هوائي ، ضع السمكة بحيث يميل الرأس إلى أسفل قليلا للسماح بوصول أفضل إلى المنطقة خلف قوس الخياشيم الرابع. ارفع الرأس برفق باستخدام ملقط نمط قياسي مستقيم ، ثم ضع ضاغطات الأنسجة بين الرأس وداخل الرأس. افتح مباعدات الأنسجة بعناية لإبعاد الرأس عن الرأس وإبقاء الخياشيم مكشوفة.

ضع مقابض الضام بجوار الرأس لتوفير الوصول إلى جميع أقواس الخياشيم الأربعة. تأكد من أن محلول التخدير يروي الخياشيم وضع ملقط قياسي منحني أو مستقيم بين قوس الخياشيم الرابع ومؤخرة الرأس. افتح الملقط برفق لخلق توتر في الرباط.

ربط قوس الخياشيم الرابع بالرأس بزوج من الملقط رقم خمسة. قم بإنشاء فتحة من اثنين إلى ثلاثة ملليمترات عن طريق ثقب الظهارة ، وربط الطرف الظهري للأقواس الخيشومية بالتجويف الأذني. احرص على عدم التعمق كثيرا لأن هناك خطر إتلاف أحد الأوعية الدموية الرئيسية.

بعد ذلك ، أمسك برعم قطن صغير مع ملقط رقم خمسة ، واستخدمه لتوسيع الشق بعناية لكشف الأعصاب التاسع والعاشر. حرر الأعصاب من أي نسيج ضام باستخدام الملقط رقم خمسة. مرة أخرى ، الحرص على عدم إتلاف الأوعية الدموية.

بمجرد أن يتم الكشف عن الأعصاب وتحديدها ، استخدم مقص الزنبرك المنحني لقطع الأعصاب بعناية أثناء الضغط على الشق. افتح باستخدام ملقط الشكل القياسي المستقيم. بعد قطع الأعصاب ، اسحب الملقط المنحني برفق وقم بإزالة الأنسجة.

خيوط الضام غير مطلوبة لأن الشق يجب أن يغلق من تلقاء نفسه في غضون 24 إلى 48 ساعة. بعد تكرار الإجراء على الجانب الآخر من الرأس ، قم بتبديل ري الخياشيم من مخدر إلى ماء خلوي عذب واسمح للأسماك بالتعافي من التخدير. بمجرد استئناف حركات الأذن ، انقل الأسماك إلى أحواض تجريبية للتعافي لمدة 24 ساعة على الأقل.

أخيرا ، قم بإجراء زائف على مجموعة منفصلة من الأسماك عن طريق ثقب الظهارة خلف قوس الخياشيم الرابع دون قطع الأعصاب قبل القتل الرحيم للسمكة. ضع ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من 4٪ PFA في قارورة التلألؤ. استخدم قارورة واحدة لكل قوس خيشوم.

بالإضافة إلى ذلك ، خذ قاربا صغيرا من مصل اللبن واملأه ب XPBS واحد. سيتم استخدام هذا لغسل الأنسجة بعد استئصالها. احتفظ بجميع الحلول على الجليد.

بعد القتل الرحيم للأسماك بجرعة زائدة من البنزوكايين ، استخدم ملقطا غير حاد لرفع التجعيد على جانب واحد من الرأس ومقص منحني لقطع كل طرف من طرفي سلة الخياشيم العضدية. بعد ذلك ، استخدم ملقطا حادا لالتقاط الخياشيم بعناية بواسطة Rackers ورفعه من التجويف الأذني. اغسل الخياشيم على الفور في البرد المثلج لإزالة البنزين الزائد والدم وضع الخياشيم المستأصلة في قارورة مملوءة بنسبة 4٪ PFA لإصلاح جميع الخياشيم المستأصلة طوال الليل عند أربع درجات مئوية بعد التثبيت.

اغسل X-S-P-F-A في XPBS واحد ، وضع المنديل في أنبوب رصاصة سعة ملليلتر مملوء ب 1.5 مل من 1٪ Tritton x. ضع أنابيب الرصاصة على شاكر لمدة ست ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. لاختراق الأنسجة ، قم بإعداد تخفيف واحد إلى 250 لكل جسم مضاد أساسي عن طريق إضافة أربعة ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية NKA و ZN 12 إلى 992 ميكرولترا من XPBS واحد.

تأكد من رفع كلا الجسمين المضادين الأساسيين في نفس المضيف. استنشق محلول Triton X وبدون غسل الأنسجة أولا ومحلول الأجسام المضادة الأولية واحتضانه على شاكر لمدة ست ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، استنشق محلول الجسم المضاد الأساسي واغسل الجسم المضاد الأساسي ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منهما.

باستخدام XPBS واحد. قم بإعداد الجسم المضاد الثانوي عند تخفيف من واحد إلى 200 عن طريق خلط خمسة ميكرولترات من الجسم المضاد الثانوي في 995 ميكرولتر من XPBS واحد. بعد شفط PBS من آخر غسلة ، ضع الجسم المضاد الثانوي واحتضنه لمدة ست ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية على شاكر.

أخيرا ، قم بإزالة أي جسم مضاد ثانوي زائد عن طريق غسل الأنسجة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها كما كان من قبل ، بعد أن تقوم الغسالات بتركيب الأنسجة عن طريق وضع الخياشيم أولا في قطرة 200 ميكرولتر من XPBS واحد على شريحة مجهر مسطحة. للتأكد من أن الأنسجة لا تجف. افصل الحواف الخيشومية مع مقص صغير منحني.

ثم ضع قطرة من XPBS وقطرة من وسائط التركيب في منخفض شريحة مقعرة. ضع الضربات الفاصلة المنفصلة في الشريحة المقعرة بحيث تكون الحافة الأمامية للفتيل متجهة لأعلى وقم بتغطيتها بقلة غطاء على حواف زلة الغطاء بطلاء الأظافر. من أجل منع انزلاق الغطاء من التحرك وإزاحة الأنسجة ، اترك الأنسجة تستقر في الجزء السفلي من الشريحة المقعرة لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل التصوير.

لكل قوس خيشومي ، حدد ستة خيوط خيشومية بشكل عشوائي للتصوير لإنتاج ست صور لكل قوس خياشيم. استخدم الفحص المجهري متحد البؤر التقليدي لتصوير الأنسجة عن طريق أخذ شريحة بصرية من واحد إلى ثلاث ميكرومتر في الصور التالية ، تم تلطيخ الخلايا المشار إليها برؤوس الأسهم بالجسم المضاد ألفا الخمسة والأعصاب المشار إليها بالسهام تم تلطيخها بالجسم المضاد ZN 12. تظهر هذه الصورة متحدة البؤر لخيوط الخياشيم من سمكة التحكم تعصيبا خارجيا مع تفرع صفيحة واسع النطاق لحزمة العصب المركزي ، ويفترض أنها تنشأ من الأعصاب التاسع والعاشر كما هو موضح في الصورة الداخلية.

بعض الخلايا المشار إليها معصبة أيضا. تظهر هذه الصورة خيوطا خيشومية بعد يومين من إزالة التعصيب الثنائي الكامل. كان هناك انخفاض في حزمة العصب المركزي بينما بدا التعصيب الصفحي سليما إلى حد كبير.

هنا ، يظهر خيوط الخياشيم بعد خمسة أيام من إزالة التعصيب الثنائي الكامل يوضح أن التعصيب الخارجي غائب الآن إلى حد كبير. يشير التحليل النوعي إلى أن إزالة التعصيب الثنائية الكاملة تسبب تدهور التعصيب الخياشيم الخارجي مع الحفاظ على الأعصاب مع أجسام الخلايا داخل خيوط الخياشيم ، مما يخلق شبكة من الأعصاب من خلال الفتيل وفي العرج. يمكن أن يقترن هذا الإجراء بطرق أخرى مثل قياس تدفقات الأيونات ، باستخدام الأيونات المشعة مثل الصوديوم 22 من أجل الإجابة على أسئلة بحثية إضافية.