المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجاوز قيود التألق المناعي غير المباشر لدراسة الخلايا السلفية العصبية. عندما لا تتوفر الأجسام المضادة الأولية المناسبة من الأنواع المضيفة المختلفة. في البداية ، يتم حقن نظير الثايميدين لتسمية الخلايا المنقسمة ، وبعد ذلك يتم حصاد الأنسجة ومعالجتها وتقطيعها إلى أقسام تبريدية.

ثم يتم إجراء التألق المناعي المتعدد المتسلسل للبدء. يتم تطبيق جسم مضاد أولي غير مسمى ، والذي يتم ربطه بعد ذلك بجسم مضاد ثانوي مصنف بالفلورسنت. بعد ذلك ، يتم حظر الأنظار المفتوحة على الجسم المضاد الثانوي الأول بمصل من أنواع الأجسام المضادة الأولية ، ويتم تغطية جميع الغلوبولين المناعي الذي يمكن التعرف عليه بواسطة الجسم المضاد الثانوي الثاني بشظايا فاب غير مترافقة.

يسمح ذلك بمعالجة الأنسجة بجسم مضاد أساسي ثان ، والذي يمكن تصنيفه بواسطة جسم مضاد ثانوي مختلف. في النهاية ، يتم استخدام صور الأقسام لدراسة تطور وتنظيم الخلايا السلفية العصبية استجابة لمنبهات محددة ومشاركتها في وظائف معينة للدماغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التألق المناعي المتعدد المتزامن ، هي أنها تتحايل على المشكلات التي تنشأ عادة عن الحاجة إلى استخدام الأجسام المضادة الأولية التي يتم تربيتها في نفس الأنواع المضيفة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكوين الخلايا العصبية للبالغين ، مثل تكاثر مجموعات فرعية من سلف الحصين استجابة للمنبهات الفسيولوجية أو الدوائية أو أمراض الدماغ أو الشيخوخة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن وضع العلامات المتعددة بالأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة قد يؤدي إلى أنشطة عبور غير مرغوب فيها للأجسام المضادة دون حظر كاف. أولا ، قم بوزن المراد حقنها وقم بإعداد محلول مخزون تناظري طازج 10 ملليغرام لكل مليلتر من الثايميدين للحقن.

عندما يكون المحلول جاهزا ، قم بإعداد جرعة معدلة الوزن في حقنة جرعة دقيقة بإبرة قياس 30. ثم كبح جماح الماوس عن طريق القفظ وحقن الثيميدين التناظرية داخل الصفاق في النقطة الزمنية المطلوبة ، وقم بتخدير الفأر بعمق والقلب العابر. قم بتثبيته ب 10 مل من PBS المثلج ، متبوعا ب 40 مل من محلول الفورمالديهايد المثلج الطازج.

ثم قم بتشريح الدماغ ونشره ، وقم بإصلاحه في نفس المثبت بعد التثبيت. احتضان الأدمغة المجمعة لمدة 24 ساعة في 10٪ سكروز عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، انقل الأدمغة إلى 30٪ من السكروز واحتضانها لمدة 48 ساعة أخرى.

مع استعداد الأدمغة للحماية بالتبريد ، قم بتجميدها في سالب 25 درجة مئوية isop pentane. في وقت لاحق ، استخدم ناظم البرد لقطع أقسام إكليلية بحجم 40 ميكرون للتخزين طويل الأجل. انقل الأقسام إلى محلول مضاد للتجمد واحتفظ بها عند سالب 20 درجة مئوية.

ابدأ بنقل الأقسام من محلول التجمد إلى TBS بمساعدة فرشاة دقيقة. اشطف الأقسام جيدا ، بدءا من الغسيل طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، متبوعا بخمس غسلات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يجب إجراء كل هذه الحضانات مع التحريض اللطيف المستمر.

إذا كان أحد المستضدات ذات الأهمية هو نظير الثايميدين ، فيجب تنفيذ خطوة تمسخ حمض الهيدروكلوريك في هذه المرحلة ، متبوعة بخطوة تحييد في المخزن المؤقت للتجويف. استمر في اختراق وحظر مواقع ربط الأجسام المضادة غير المحددة في TBS plus. دع هذه الحضانة تذهب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتضن أول جسم مضاد أولي مخفف في TBS بالإضافة إلى الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي.

اغسل الأقسام ثلاث مرات في TBS ومرة واحدة في TBST. دع كل حمام لمدة 10 دقائق. ثم احتضان في أول جسم مضاد ثانوي مترافق بالفلوروكروم لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.

من الآن فصاعدا ، قم بحماية الأقسام من التعرض للضوء. بعد سلسلة غسيل أخرى ، انقل الأقسام إلى محلول مصل من الأنواع المضيفة بنسبة 10٪ تم صنع الجسمين المضادين الأساسيين منه. احتضان الأقسام في هذا المحلول لمدة ثلاث ساعات لتشبع الأجزاء المفتوحة على الجسم المضاد الثانوي الأول.

اشطفها لاحقا ثلاث مرات في TBS ومرة واحدة في TBST لإزالة المصل. ثم قم بإعداد محلول TBS plus مع 50 ميكروغراما لكل مليلتر من شظايا المصباح أحادي التكافؤ غير المترافقة الموجهة ضد الأنواع المضيفة للجسم المضاد الأساسي. يغطي هذا الحلقات التي يمكن التعرف عليها بواسطة الجسم المضاد الثانوي الثاني.

انقل الأقسام إلى هذا المحلول واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اشطف الأقسام ثلاث مرات على الأقل في TBS ومرة واحدة في TBST. أثناء عمليات النقل ، قم بمسح الحشوات الشبكية التي تحتوي على الأقسام الموجودة على منشفة ورقية لإزالة الخلفات المتبقية.

الآن احتضان الأقسام في الجسم المضاد الأولي الثاني بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد سلسلة غسيل أخرى ، ضع الجسم المضاد الثانوي الثاني لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، اغسل الأقسام ثلاث مرات في TBS واستمر في تركيب أقسام الجيلاتين.

قم بتجفيف الشرائح في الهواء وقم بتغطيتها باستخدام صورة متوسطة تركيب ANTIFA. الأقسام المصنفة المضان بمجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر. التقط مجموعات الصور في مواضع عشوائية على طول مدى التلفيف المسنن بالكامل بتكبير 400 ضعف.

قم بتحليل ما لا يقل عن 50 خلية ذات أهمية مختارة عشوائيا لكل نصف كرة من أجل وضع العلامات المشتركة على العلامات المختلفة. لحساب الأرقام المطلقة لمجموعات خلايا حديثي الولادة محددة ، اضرب النسب المئوية للخلايا ذات العلامات المشتركة مع العدد الإجمالي للخلايا حديثة الولادة كما تم تقديرها من تحليل تلطيخ DAB. تم استخدام الطرق الموصوفة لتحديد وتوصيف الخلايا حديثة الولادة في الحصين بعد الولادة والبالغين لدورة ناقصة تكوين الخلايا العصبية.

D اثنين من نموذج الفأر بالضربة القاضية ، تلطيخ DAB ضد علامات الانتشار المختلفة مثل KI 67 أو BRDU كشف باستمرار عن اختلافات في أعداد خلايا الأطفال حديثي الولادة بين الفئران البرية والفئران بالضربة القاضية. يمكن تنميط الخلايا حديثة الولادة المسمى BRDU باستخدام بروتوكول التألق المناعي المتعدد التقليدي لتطبيق الأجسام المضادة الأولية في وقت واحد ضد عش B-R-D-U-G-F-A-P في GFP والكورتين المزدوج. سمح ذلك بالتعرف الناجح على خلايا السلف حديثي الولادة من النوع الأول والنوع الثاني أ والنوع الثاني ب والنوع الثالث داخل عينة واحدة.

بدلا من ذلك ، مع فترات زمنية أطول بين حقن BRDU والتضحية بالحيوان ، يمكن تحليل الأعداد النهائية للخلايا العصبية حديثي الولادة عن طريق تلطيخ مناعي BRDU الجديد المتزامن. عمل بروتوكول وضع العلامات المناعية المتسلسلة بشكل مثالي إذا تم احتضان الأقسام لأول مرة في وقت واحد مع الأرانب المضادة ل KI 67 ، والماعز المضاد ل GFP ، وخنزير غينيا المضاد للأجسام المضادة للطوق المزدوج ، وثانيا ، مع الجسم المضاد للأرانب المضاد ل GFAP ، ولكن ليس العكس. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور ما يصل إلى أربعة مستضدات مختلفة في قسم الأنسجة المفردة باستخدام الأجسام المضادة الأولية التي يتم رفعها في نفس المضيف.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تضمين عناصر التحكم المناسبة للقضاء على احتمالية وجود أجسام مضادة أو تفاعلية متقاطعة أو إيجابيات خاطئة. اعلم أن تسلسل حضانات الأجسام المضادة الأولية قد يؤثر بشدة على نتيجة البروتوكول.