متساوي التضخيم (LAMP) فحوصات بوساطة حلقة للكشف عن أنواع محددة من

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشخيص حدوث طفيليات من نوع I myea في قطيع الدجاج أو الدجاج. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الكواشف أولا للتضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة أو تفاعل المصباح. بعد ذلك ، يتم تحضير الحمض النووي الجيني الكلي من موقع معوي واحد أو أكثر بعد الوفاة.

ثم يضاف الحمض النووي الجيني إلى مزيج المصباح الرئيسي ويحتضن. أخيرا ، يتم تقييم نتيجة اختبار المصباح. في النهاية ، يتم استخدام LAMP لتحديد حدوث أنواع معينة من I miria لتحسين إدارة المخزون وكأداة لتشخيص المرض.

لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق التقليدية مثل الفحص المجهري المورفولوجي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل لأنها أقل ذاتية ولا تتطلب مرافق معملية باهظة الثمن. يمكن أن يؤدي استخدام هذا النهج إلى تحسين صحة الدجاج ورفاهيته من خلال تحسين تشخيص عدوى الآريان. لإعداد قالب مصباح Erea ase ، اختر قسم الأمعاء المراد اختباره.

استخدم هذا الجدول كدليل لاختيار الموقع عينة وأنواع الإيريا التي من المرجح أن تكون موجودة. هذا له أهمية رئيسية لأن كل نوع يصيب الدجاج يتم تحديده من خلال المنطقة المعوية التي يستهدفها باستخدام مقص معقم أو مشرط. استكشاف خمسة سنتيمترات أو أطول من الأقسام المعوية المختارة لاختبار eria.

قطع العينة مفتوحة طوليا. قم بإزالة معظم محتويات الأمعاء واستخدم حافة المجهر الزجاجي المعقم. حرك شفرة المقص أو تعقيمها لكشط الخلايا من الطبقة المخاطية.

ضع المادة المكشطة في أنبوب طرد مركزي صغير معقم بحجم 1.5 ملليلتر يحتوي على 100 ميكرولتر من TE المعقم بوزن 10٪ ، ولكن خلية الحجم × 100 راتنج وبرغي بإحكام في الأعلى. رج العينات بقوة لمدة دقيقة واحدة ، ثم احتضانها في حمام مائي مغلي لمدة 10 دقائق. بعد الغليان ، اترك كل عينة لتبرد في درجة الحرارة المحيطة لمدة دقيقة إلى دقيقتين.

الطرد المركزي العينات عند 10 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة قبل جمع ميكرولترين من المادة الطافية لكل مقايسة مصباح لاستخدامها كقالب لإعداد مخزون أولي لمصباح ميريا مناسب ل 100 فحص. أعد تكوين كل برايمر مصباح I miria المجفف بالتجميد عن طريق إضافة ماء من الدرجة الجزيئية إلى تركيز 100 ماصة ميكرومولار 60 ميكرولتر من الماء من الدرجة الجزيئية في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل سعة 0.5 ملليلتر لكل نوع من أنواع iria ليتم فحصها. باستخدام وحدة التخزين الموضحة في هذا الجدول.

أضف الاشعال ، F-I-P-B-I-P-F ثلاثة B وثلاثة LF و LB خاصة بأنواع eria المستهدفة إلى الماء. إنشاء سلسلة من سبعة أنواع من الخلطات التمهيدية. اقلب المحاليل الأولية لفترة وجيزة لخلطها ، ونبض الطرد الصغير ، وقم بتجميدها لحين الحاجة.

باستخدام الأحجام المدرجة في هذا الجدول والمبادئ التوجيهية الواردة في بروتوكول النص ، قم بإعداد مزيج تفاعل المصباح الرئيسي لكل نوع من أنواع iria ليتم فحصه لتنفيذ ماصة فحص المصباح 23 ميكرولترا من مزيج مصباح البوليميراز الخاص بأنواع IEA في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر. أضف ميكرولترين من قالب الحمض النووي المعد مسبقا مما يجعل حجم التفاعل النهائي يبلغ 25 ميكرولترا كعنصر تحكم إيجابي. أضف ميكرولترين من الحمض النووي الجيني الخاص بأنواع الإيريا إلى تفاعل واحد.

أضف ميكرولترين من الماء الجزيئي إلى التفاعل كعنصر تحكم سلبي يحتضن حمام مائي أو كتلة حرارية عند 62 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اختياريا، قم بإلغاء تنشيط بوليميراز B-S-T-D-N-A عن طريق التسخين إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إذا لم تتم قراءة التفاعل على الفور في نهاية الحضانة تحت الضوء الداخلي ، فقم بتقييم لون كل تفاعل بالعين.

ستظهر النتائج السلبية باللون الوردي إلى البنفسجي وستظهر نتائج إيجابية. أزرق سماوي اختياريا. لتأكيد نتيجة فحص المصباح ، امزج خمسة ميكرولترات من منتج تفاعل المصباح مع ميكرولتر واحد من المخزن المؤقت لتحميل هلام الحمض النووي وقم بتشغيله على هلام ARO 2٪ مسبقا.

استخدم سلم الحمض النووي بحجم جزيئي ذو قاعدة قاتلة واحدة لتحديد حجم الجزء اختبار ثلاثة. الطيور التي تم جمعها من مزرعة دجاج التسمين الأمريكية كجزء من برنامج المراقبة أسفرت عن ثلاث مجموعات من العينات المعوية كما هو موضح هنا. التطبيق المستهدف لمقايسات المصباح الخاصة بالأنواع وتحديد أولويات المواقع المعوية المفضلة لكل I miria.

سمحت الأنواع بالتعرف البصري على عدوى إيريان في جميع الطيور التي تم اختبارها باستخدام هيدروكسي الولادة الأزرق كمؤشر. يمكن أن يتراوح اللون الذي يتم تحقيقه من تفاعل المصباح السلبي عند استخدام الهيدروكسي من البنفسجي إلى الوردي ، ولكنه يختلف دائما عن اللون الأزرق الذي يتم تحقيقه من خلال نتيجة إيجابية. قدم التأكيد عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام aose نتائج قابلة للمقارنة كما هو موضح هنا.

إن تحضير الحمض النووي من عينة واحدة مسحوبة لكل طائر تمثل المواد التي تم جمعها من كل موقع من مواقع الأمعاء المحددة واختبارها باستخدام جميع فحوصات المصباح السبعة قدم نفس النتيجة كما هو الحال عندما تمت معالجة كل موقع معوي على حدة بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 45 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بعد هذا الإجراء. يمكن أيضا إجراء تقنيات أخرى مثل تسجيل الآفات من أجل تقييم صحة الأمعاء بشكل عام.