الذهب Nanorod بمساعدة تحفيز البصري من الخلايا العصبية

يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام التسخين العابر المرتبط بالامتصاص البصري للقضبان النانوية الذهبية لتحفيز التمايز ونشاط الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية. من المحتمل أن تفتح هذه النتائج تطبيقات جديدة في الأطراف الاصطناعية العصبية والدراسات الأساسية في علم الأعصاب.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز الخلايا العصبية المزروعة بقضبان نانو ذهبية باستخدام صمام ثنائي ليزر قريب من الأشعة تحت الحمراء. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الجسيمات النانوية للذهب أولا بالكثافة البصرية الصحيحة. الخطوة الثانية هي زراعة الخلايا العصبية وإضافة الجسيمات النانوية إليها.

الخطوة التالية هي تشعيع الليزر. الخطوة الأخيرة هي التحقق من تمايز الخلايا من خلال بيتا ثلاثة إلى تعبير توبولين. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لإظهار عابر الكالسيوم داخل الخلايا.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما نبحث عن طريقة لتحفيز إمكانات الفعل في الخلايا العصبية المفردة بين مجموعة الخلايا. سيعرض الإجراء جيمي ماي وطلاب البكالوريوس من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء ، ضع طبيبا بيطريا لمحلول قضيب النانو الذهبي في مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية.

قم بقياس الكثافة البصرية الأولية عن طريق تسجيل قيم الامتصاص من 300 نانومتر إلى 1000 نانومتر بدقة تتراوح بين 0.5 إلى نانومترين. قم بإعداد محلول مخزون سعة مليلتر واحد عن طريق تخفيف عينة أنورو الذهب الأولية إلى كثافة بصرية لجهاز طرد مركزي واحد. مليلتر واحد من محلول قضيب النانو الذهبي مرتين لإزالة أي فائض كيميائي.

ثم قم بإزالة المواد الطافية وإعادة تعليق قضبان النانو الذهبية في الماء منزوع الأيونات. للتحضير للاستخدام في زراعة الخلايا ، قم بصوتنة محلول Anoro الذهبي لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتعقيمه بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. في هذا الإجراء ، قم بإعداد 500 مل من dmem المعقم لوسط زراعة الخلايا.

بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا العصبية NG 1 0 8 15 في 10 مل من وسط زراعة الخلايا في قارورة T 75 ، ثم يتم تحضينها لاحقا عند 37 درجة مئوية وجو رطب. عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 70 إلى 80٪ ، قم بتغيير الوسط بوسط دافئ وطازج. بعد ذلك ، افصل الخلايا ميكانيكيا عن طريق طرق الجزء السفلي من القارورة المتقاربة برفق.

قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة خمس دقائق عند 600 جم وأعد تعليق لوحة الخلايا في ملليلترين من وسط تمايز الخلايا الدافئة. ثم انظر إلى الخلايا في صفيحة 96 بئر مع 200 ميكرولتر من وسط تمايز الخلايا. احتضان العينة ليوم واحد عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، أضف محلول قضيب النانو الذهبي واحتضنه لمدة 24 ساعة إضافية. في هذا الإجراء ، قم بإقران الليزر بألياف ضوئية أحادية الوضع وقم بإنهائها بموصل FC. قم بقياس طاقة الليزر الناتجة باستخدام مقياس طاقة قياسي في اليوم الثالث من حضانة قضيب النانو.

قم بتثبيت موصل FC في البئر ، وقم بإشعاع العينة والتحكم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة في موجة مستمرة بقوى ليزر مختلفة في اليوم الخامس ، وقم بإزالة وسيط تمايز الخلية من العينة وإصلاحه بحجم 3.7٪ لكل حجم محلول فورمالديهايد لمدة 10 دقائق. ثم نفاذية الخلايا بنسبة 0.1٪ حجم لكل حجم Triton X 100 لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 3٪ من الوزن لكل حجم BSA إلى العينة لمدة 60 دقيقة.

لمنع مواقع ربط البروتين غير التفاعلية ، قم بتسمية العينة بمضادات بيتا ثلاثة توبولين طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، احتضن الخلايا لمدة 90 دقيقة في الظلام بجسم مضاد ثانوي مناسب. بعد ذلك ، قم بتسمية نوى الخلية ب DAP E لمدة 10 دقائق.

ثم قم بتصوير العينة باستخدام مضان epi أو الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام هدف 20 × على الأقل. اختر مرشحات المجهر وفقا للجسم المضاد الثانوي وحدد مرشح DAPI لتصور نوى الخلية. في هذه الخطوة ، قم بإعداد محلول مخزون بوزن 20٪ لكل حجم من الأونيك F1 27 عن طريق إذابة جرامين من المذاب في 10 ملليلتر من DMSO.

سخني محلول الأونيك F1 27 عند 40 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لزيادة الذوبان. في اليوم الثالث من حضانة anaro ، قم بإعداد محلول ملح متوازن. بعد ذلك ، قم بإزالة وسيط تمايز الخلية واستبدله بمحلول BSS.

مكمل بخمسة ميكرومولار من الأنفلونزا ، 4:00 صباحا في DMSO و 0.1٪ وزن لكل حجم من محلول مخزون Onic F1 27. بعد ذلك ، قم بإقران الليزر بألياف ضوئية أحادية الوضع وشق الحافة. باستخدام التقنية القياسية.

راقب الطرف الناتج تحت المجهر البصري للتأكد من أن الطرف مسطح وعمودي على محور الألياف. ثم قم بقياس طاقة الليزر الناتجة باستخدام مقياس الطاقة القياسي. بعد ذلك ، أدخل ألياف توصيل الضوء في حامل الألياف الضوئية وقم بتثبيتها على محدد الموضع الصغير.

بعد ذلك ، قم بتوصيل راسم الذبذبات بمولد الإشارة. لمراقبة التعديل البصري. استخدم إشارة ثنائية ذات ترددات متغيرة وأطوال نبضية.

ثم قم بتوصيل الليزر واستخدم إشارة التعديل كمدخل TTL للمجهر. استخدم ليزر أيون الأرجون لإثارة صبغة الأنفلونزا الداخلية أوه 4:00 صباحا والليزر المتزامن dde. لإثارة قضبان النانو التكريبية الداخلية ، ضع الخلايا تحت مجهر متحد البؤر المقلوب وضع ألياف توصيل الضوء بعيدا عن الخلية المستهدفة في وضع إضاءة الإرسال.

ثم احسب نصف قطر الشعاع عند الهدف. قم بإجراء تصوير العينة والتحكم في درجة حرارة الغرفة باستخدام هدف 40 × وجمع عمليات مسح السلسلة الزمنية بدقة 256 × 256 بكسل لكل إطار في وضع الرحلة ذهابا وإيابا. ثم قم بإجراء التسجيل دون أي إثارة ليزر DIO من أجل تحديد أي تداخل أساسي في ليزر أيون الأرجون الموضح هنا هو صورة مضان epi لخلايا الروال المتمايزة NG 1 0 8 15 المزروعة بمفردها وتشعيعها بقوة الليزر 7.5 واط سنتيمتر مربع.

وهذه صورة للخلايا المزروعة بقضبان نانو ذهبية مشعة بقوة ليزر تبلغ 1.25 واط سنتيمتر مربع. فيما يلي مثال على الخلايا العصبية المتمايزة NG 1 0 8 15 المحملة بمؤشر الكالسيوم الأنفلونزا أوه 4:00 صباحا. تم التقاط الصورة باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب مع هدف غمر الزيت 40 ×.

يوضح هذا الشكل العينات التمثيلية لتغيرات الكالسيوم المستحثة بالليزر كدالة للوقت. في NG 1 0 8 15 ، تمت زراعة الخلايا العصبية في ظروف خالية من المصل لمدة ثلاثة أيام باستخدام قضبان نانو ذهبية من البوليسترين سلفونات ، وقضبان نانو ذهبية ، وبدون قضبان نانوية. F max over F zero يشير إلى زيادة الحد الأقصى للتألق المكتشف في NG 1 0 8 15 خلية عصبية بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للتطبيق المستقبلي في محاكاة البصريات للخلايا العصبية.