الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

تقوم هذه التجربة بفحص المكتبات الكيميائية بحثا عن المركبات التي تعدل آليات التحكم بعد النسخ عبر المنطقة الرئيسية الثلاثة غير المترجمة من النصوص أولا ، حدد المنطقة الرئيسية الثلاث غير المترجمة ذات الأهمية في الجين المستهدف. استنساخ هذه UTR الثلاثة الأولية في البلازميد مراسل التحكم في El luciferase لإنشاء El luciferase ثلاثة نسخة خيميرية UTR.

ثم بثبات. دمج البلازميدين في خط خلية ذات صلة بالمرض بذرة الخلايا التي تحمل النسخة الخيمرية في 96. تعالجهم ألواح الآبار بمكتبة من المركبات لمدة 24 ساعة ثم تحدد الجزيئات التي تؤثر على نشاط لوسيفيراز.

يختار الكرز الجزيئات المحددة لمزيد من فحص التحقق من الصحة ، وبعد ذلك ، عالج كل من خلايا التحكم والخلايا التي تحمل لوسيفيراز ثلاثة نسخ خيميرية UTR أولية مع مجموعة فرعية من مكتبة مختارة من الكرز. ستختلف النتائج إذا تم التوسط في تأثير المركب عبر المنطقة الأولية الثلاث غير المترجمة أو عبر تسلسلات متجهة أخرى. على عكس معظم مقالات الفحص القائمة على المراسلين.

المقايسات التي تركز على تنظيم النسخ ، تركز هذه المقايسة القائمة على خلية التقرير على تحديد المركبات التي تعدل مستويات نسخ الرنا المرسال عبر ثلاث مناطق أولية ومترجمة. حصاد خلايا الورم الأرومي العصبي المنقولة بثبات بواسطة التربسين الآسيوية. خفف الخلايا بتركيز اثنين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر.

في RPMI تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ L-glutamine ل 27 لوحا. قم بإعداد ما لا يقل عن 250 مل من تعليق الخلية، مع مراعاة مناولة السوائل والأحجام الميتة للحوض الصغير وخطوات سحب العينات المتكررة. ثم صب معلق الخلية في خزان معقم وضعه على مكتب الروبوت.

قم بتحميل تسعة مسطحات بيضاء مشفرة. أسفل 96 لوحة بئر وصندوق من 200 ميكرولتر أطراف ماصة معقمة على مكتب الروبوت. امزج معلق الخلية ، ثم قم بتوزيع 75 ميكرولترا من الخلايا في كل بئر من تسعة أطباق.

قم بتغطية الألواح واسمح للخلايا بالترسيب في قاع البئر لمدة 30 دقيقة لتقليل تأثيرات الحافة. ثم ضع جميع الأطباق التسعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون واحتضانها لمدة 24 ساعة. وبالمثل ، تابع اللوحات المتبقية تسعة في المرة الواحدة.

قم بإذابة أطباق المكتبة المركبة في درجة حرارة الغرفة. املأ حطارا واحدا ب PBS معقم وآخر ب 0.5٪ DMSO في محلول PBS وضعه على مكتب الروبوت. لكل لوحة مكتبة.

التحضير والمسمية وفقا لذلك. لوحة تخفيف واحدة. الآن املأ كل بئر من الأعمدة ، من اثنين إلى 11 من ألواح التخفيف ب 398 ميكرولتر من PBS المعقمة.

ثم املأ العمودين الأول و 12 ب 50 ميكرولتر من 0.5٪ DMSO في PBS المعقم. بعد ذلك قم بتحميل لوحين التخفيف. طبقتان للمكتبة وصندوقين من أطراف معقمة سعة 50 ميكرولتر وستة أطباق خلوية على مكتب الروبوت.

الآن اكتشف ألواح الخلية ، وقم بتقطيع اثنين من ميكرولترين من محلول المخزون 10 ملليمولار من إحدى لوحين من لوحين مكتبيين في لوحة التخفيف المقابلة واخلطيها جيدا. باستخدام نفس مجموعة النصائح. انقل ثلاثة ميكرولترات من التخفيف 50 ميكرومولار إلى ألواح الآبار البيضاء الثلاث ذات الباركود 96 التي تحتوي على الخلايا.

استبدل المجموعة الكاملة من النصائح وكرر تحريض الخلايا للوحة المكتبة الثانية. غطي الثقافات واحتضنها لمدة 24 ساعة. ثم كرر عملية التخفيف المركب وتحريض الخلية للوحات المكتبة المتبقية.

موازنة كاشف لوسيفيراز المعاد تشكيله المفضل مع درجة حرارة الغرفة. ضع خزان لوسيفيراز على مكتب الروبوت واسكب الكاشف فيه. قم بإزالة تسعة أطباق من الثقافات المستحثة من الحاضنة.

ضعها على مكتب الروبوت ، واكشف عنها وتوازن معها مع درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 50 ميكرولترا من كاشف اللوسيفيراز لكل بئر بين الألواح. أدخل تأخيرا يساوي وقت قراءة اللمعان للوحة واحدة.

بعد حضانة لمدة 30 دقيقة. قم أولا بتسجيل الرمز الشريطي للوحة من أجل ربطه بملف البيانات المقابل. بعد ذلك ، ضع اللوحة الأولى في مقياس الإضاءة وقم بقياس اللمعان.

بعد خطوة اهتزاز قصيرة ، كرر قراءات التلألؤ لجميع لوحات الحث. ثم اجمع كاشف سباق لوسيفر المتبقي وقم بتخزينه عند سالب 20 درجة مئوية. بمجرد معالجة البيانات التجريبية للفحص الأولي ، حدد النتائج لتأكيد خصوصية المركب بواسطة كرز الفحص المضاد.

اختر النتائج المحددة وأنشئ تخطيطا للوحة الفحص الجديدة، بما في ذلك مواضع عناصر التحكم. ثم من الحصص المخزنة في أنابيب مفردة ثنائية الأبعاد مشفرة ، قم بإنشاء لوحات HIIT جديدة. اتباع نفس البروتوكول للفحص.

قم بإعداد 3 96 لوحة بئر من كل خط خلية مستقر لكل لوحة عالية. في اليوم التالي ، عالج الخلايا بمركبات المكتبة. استخدم كل لوحة عالية لمعالجة ثلاث لوحات من CHP 1 34 micken وثلاثة UTR رئيسي وثلاث لوحات مع خلايا تحكم بتركيز عمل ميكرومولار في 24 ساعة.

قم بقياس نشاط لوسيفيراز في جميع لوحات CHP 1 34 ، ومجموعات التحكم والتحكم الرئيسية الثلاثة. كما هو الحال مع تحليل البيانات في الفحص الأولي ، قم بتطبيع البيانات التجريبية من الآبار المعالجة إلى متوسط الضوابط المعالجة بالمركبات على اللوحة. ثم احسب المتوسط والانحراف المعياري على التكرارات لكل حساب مركب تم اختباره.

تغيير أضعاف نشاط لوسيفيراز في CHP 1 34 McIn ثلاثة UTR رئيسي مقابل CHP 1 34. تحدد خلايا التحكم قطع التغيير الكامل التعسفي الأكبر من 1.5 وقيم P ذات الأهمية أقل من 0.01. قامت هذه التجربة بفحص مكتبة مركبة عام 2000 بحثا عن المعدلات المحتملة لآليات التحكم بعد النسخ التي تمارس من خلال UTR الثلاثة الأولية للميكروفون والجين الورمي ، نتائج إشارات لوسيفيراز للوحة مكتبة واحدة من أصل 25 ممثلة معروضة كنسبة مئوية من المركبات المعالجة.

تظهر الضوابط أن غالبية المركبات لم تتسبب في أي تأثير واضح على UTR الأولية الثلاثة. تم اختيار الضربات حيث تم حساب متوسط القيمة والانحراف المعياري على جميع قيم الفحص ، فإن المركبات التي تقلل من نشاط اللوسيفيراز أقل من 20٪ هي على الأرجح مؤشرا على السمية الخلوية الواضحة للمركب. يوضح هذا الرسم البياني نتائج تمثيلية للفحص المضاد لأربعة مركبات مختارة معينة WX و Y و Z.ينتج عن كل من المركبين W و X زيادة تعبير اللوسيفيراز من مراسل UTR الرئيسيين الثلاثة للجين المسرطن كما هو موضح من اختلاف تغيير الطية واختبار T. لاحظ أنه في حين أن تأثيرات كل من المركبين W و X تعتمد حقا على ثلاثة مركب UTR رئيسي ، فإن W ليس له تأثير كبير على بقاء الخلية.

بينما يعرض المركب X بعض النشاط السام للخلايا كما هو موضح في إشارة لوسيفيراز طبيعية في خلايا التحكم CHP 1 34 ، لا يعرض المركب Y ولا المركب Z بتركيزين ميكرومولار تأثيرا يعتمد على ثلاثة UTR أولي على مستويات لوسيفيراز. إن انخفاض نشاط اللوسيفيراز الذي تم اكتشافه في الفحص الأولي عند العلاج بمركب Y هو بالأحرى نتيجة للسمية الخلوية. في حالة المركب Z ، يرجع نشاط اللوسيفيراز المتزايد إلى غير محدد من حيث ثلاثة تنشيط UTR رئيسي للمحفز الفيروسي.

نظرا لوحظ تنظيم مكافئ في كل من مجموعات التحكم وغير المترجمة في اختبار الإنتاجية العالية هذا ، تذكر أن التحقق من صحة الحرارة الأولية في خلايا التحكم أمر بالغ الأهمية لتمييز المركبات التي تعمل حقا من خلال المنطقة الرئيسية الثلاثة غير المترجمة من تلك المركبات التي تعمل عبر المروج.