تحليل الالتهام الذاتي في

الهدف من هذا الإجراء هو تحفيز ومراقبة عملية الالتهام الذاتي في فطر خيطي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تلقيح أحجام صغيرة من وسط يحتوي على مواد مغذية بالأبواغ أو بقطع صغيرة من الغزل الفطري. وفي الخطوة الثانية، يتم تحضير وسادات تجويع في فجوات شرائح مجهرية زجاجية، ثم يُنقل اللقاح إلى هذه الوسادات.

في الخطوة النهائية، تُحضن وسادات التجويع في غرفة رطبة لتحفيز عملية الالتهام الذاتي. وفي نهاية المطاف، يمكن تتبع الالتهام الذاتي عن طريق مراقبة انتقال بروتينات العلامات الفلورية المستهدفة إلى الفجوات باستخدام المجهر الفلوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة القضايا الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية، مثل تحديد مركبات جديدة تضبط عملية الالتهام الذاتي.

للتحضير لتجربة التجويع، إذا كانت سلالة P cresa genum المطلوبة محفوظة على الأرز الأخضر، ضع أولاً حبتين إلى ثلاث حبات من الأرز المغطاة بالميسيليا في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 µL، واملأ الأنبوب بـ 500 µL من وسط نمو مستخلص الخميرة والجلوكوز أو وسط GG. ثم قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الفورتكس لمدة 30 ثانية حتى تنفصل الأبواغ عن الأرز، واحفظ الأنبوب لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة. وفي اليوم التالي، خفف معلق الأبواغ إلى تركيز 1:50 في ماء صنبور معقم واخلطه جيداً، أما إذا كانت p cryogen محفوظة على الآجار.

استخدم رأس ماصة لنقل قطع صغيرة من الميسيليوم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 400 µL من مياه الصنبور المعقمة وحوالي 100 mg من الخرز الزجاجي. بعد ذلك، قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الفورتكس لمدة دقيقتين حتى يتجزأ الميسيليوم. لزراعة PCE genum على وسادة تجويع، قم أولاً بتسخين اللوح الساخن إلى حوالي 60 °C.

بعد ذلك، يتم إذابة جرامين من aros في 100 milliliters من ماء الصنبور في الميكروويف حتى يصبح المحلول الناتج رائقاً تماماً، مع ترك aros ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة 60 degrees Celsius تقريباً. يتم ملء أنبوب micro centri بقيمة 1.5 milliliter لكل عينة بـ 400 microliters من ماء صنبور معقم أو محلول مركب. ثم تُسخن الأنابيب وشرائح المجهر على لوح التسخين لمدة 60 seconds على الأقل.

انقل 400 µL من الـ aros بدرجة حرارة 60 °C إلى جميع الأنابيب، ليصل الحجم الإجمالي في كل أنبوب إلى 800 µL، ثم قم برج الأنابيب باستخدام جهاز الفورتكس لفترة وجيزة، وبعد ذلك أعد الأنابيب إلى لوحة التسخين لمنع التصلب المبكر. الآن، اسحب 140 µL من محلول aros المناسب بواسطة الماصة وضعها في تجويف كل شريحة مجهرية. مع الحرص على عدم تكوين فقاعات، قم بتسطيح الـ aros فوراً باستخدام أغطية الشرائح، ثم اترك الشرائح لترتاح لمدة أربع دقائق تقريباً.

عند درجة حرارة الغرفة، وبمجرد أن تتصلب وسائد الأغار، استخدم الإبهام أو السبابة لإزالة شرائح التغطية بعناية، ثم ضع الشرائح المجهرية والوسائد في غرفة رطبة. بعد ذلك، انقل خمسة ميكرولتر 5 µL من مستنبت P er genum الذي تم تحضيره مسبقاً باستخدام الماصة إلى مركز وسادة التجويع، ثم غلف الغرفة الرطبة بكيس بلاستيكي لتوفير حماية إضافية ضد الجفاف، مع الحرص على عدم تحريك الصندوق كثيراً أو إزعاج المزارع. ثم خزن اللقاحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 ساعة على الأقل قبل تحليل العينات.

في اليوم التالي، انقل الشرائح إلى ورق نشاف جاف، ثم وزع 50 µL من الماء على كل وسادة تجويع. استخدم غطاء شريحة لإخراج الماء الزائد لإزالته باستخدام ورق نشاف نظيف. بعد ذلك، وبالنسبة لكل شريحة، استخدم عدسة شيئية بقوة 20x للحصول على نظرة عامة لنمو الغزل الفطري.

لتقييم تموضع الـ GFP في الـ Hy-Fi. افتح الصور باستخدام العدسة الشيئية 63 x أو 100 x. وأخيراً، أعد الشرائح إلى الغرفة الرطبة بعد كل عملية فحص حتى موعد التجربة التالي.

توضح هذه الصور أنه تم استخدام سلالة G-F-P-S-K-L-P Creo Genum لتقييم تحلل البيروكسيسومات بعد 20 ساعة من الحضن. لم يُلاحظ وجود GFP في الفجوات العصارية، كما لم تكن تلك العضيات متضخمة. ومع ذلك، عند 40 ساعة من النمو، أمكن رؤية فجوات عصارية مُعلمة بـ GFP في بعض الخيوط الفطرية، مما يشير إلى تفعيل عملية الالتهام الذاتي، مع ملاحظة استمرار تألق GFP وتضخم الفجوات العصارية عند 60 ساعة.

في هذه التجربة، تم استخدام طافر delta 80 G من سلالة p caressa Genum كضابط سلبي. يلاحظ عدم حدوث تضخم في الفجوات العصارية وغياب الـ GFP، حتى بعد 60 ساعة من النمو، كما هو ملاحظ في سلالة G-F-P-S-K-L غير المعالجة. أما كضابط إيجابي، فقد تم استخدام دواء rapamycin المحفز للبلعمة الذاتية؛ حيث أصبحت الفجوات العصارية الموّسمة بـ GFP مرئية بعد 40 ساعة من النمو، بينما امتلأت الـ Hy-Fi بالكامل بفجوات عصارية ضخمة تحتوي على GFP بحلول الساعة 60.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل عملية الالتهام الذاتي في الفطريات التي تصيب العقل (mentis fungi).