Name: تحليل الالتهام الذاتي في البنسليوم العسجدية باستخدام التجويع وسادات في تركيبة مع المجهر مضان (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: اكتشف طريقة تحليل الالتهام الذاتي في البنسليوم العسجدية باستخدام سادات التجويع والمجهر المضان. تُمكّن هذه التقنية الباحثين من دراسة آليات الخلايا وتتبع البروتينات الفلورية في الفجوات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CQS تحصل على زمالة من LOEWE Excellence Cluster للأبحاث الفطرية التكاملية (IPF). يود المؤلف أن يشكر Ida J. van der Klei على P. chrysogenum سلالات المستخدمة في هذا العمل وأندرياس س. رايشرت على هدية الرابامايسين.

1. تحضير P. chrysogenum لتجارب الجوع
<ol>
	<li>إذا تم الاحتفاظ بالسلالة ذات الأهمية P. chrysogenum على الأرز ("الأرز الأخضر") ، ضع 2-3 حبات أرز مغطاة بالفطريات الأبواغية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. املأه ب 500 ميكرولتر YGG (10 جم / لتر KCl ، 20 جم / لتر جلوكوز ، 10 جم / لتر قاعدة نيتروجين خميرة ، 5 جم / لتر K2HPO4 ، 20 جم / لتر مستخلص الخميرة).
	<ol>
		قم <li>بدوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية حتى تتمكن الجراثيم من الانفصال عن الأرز بكفاءة.</li>
		<li>احتضان الأنبوب لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال ، بين 20 و 25 درجة مئوية).</li>
		<li>قم بإعداد 1/50 مخفف من معلق البوغ هذا في ماء الصنبور المعقم ، واخلطه جيدا.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>إذا تم الاحتفاظ بسلالة P. chrysogenum ذات الأهمية على صفيحة أجار (على سبيل المثال ، صفيحة أجار YGG) ، فقم بنقل قطع صغيرة من الفطريات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 400 ميكرولتر من ماء الصنبور المعقم وحوالي 100 مجم من الخرز الزجاجي باستخدام عود أسنان معقم أو طرف ماصة.
	<ol>
		<li>دوامة الأنبوب لمدة 2 دقيقة حتى تصبح الفطريات مجزأة. استخدم محتويات الأنبوب على الفور.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. الخطوات التحضيرية لزراعة P. chrysogenum على منصات الجوع
<ol>
	<li>قم بتشغيل لوحة التسخين واضبطها على 60 درجة مئوية تقريبا.</li>
	<li>قم بإذابة 2 غرام من الاغاروز في 100 مل من ماء الصنبور عن طريق طهي المحلول في فرن الميكروويف. احرص على أن يكون هذا الحل واضحا تماما بعد التسخين. إذا لم يكن كذلك ، اطهيه مرة أخرى حتى يذوب الاغاروز تماما. دع محلول الاغاروز يبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية قبل الاستخدام.</li>
	<li>املأ 1.5 مل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (2-4 ، حسب عدد العينات) ب 400 ميكرولتر من ماء الصنبور المعقم لكل منها (بدون إضافة مركبات إضافية) أو 400 × ميكرولتر (إضافة x ميكرولتر من المحلول المركب في الخطوة 2.5) وضعها على لوح التسخين لمدة دقيقة واحدة على الأقل حتى يسخن الماء بالداخل.</li>
	<li>ضع شرائح المجهر التي تحتوي على تجويف مركزي على لوحة التسخين لمدة 1 دقيقة على الأقل.</li>
	<li>أضف 400 ميكرولتر 2٪ agarose إلى المحلول في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل والدوامة لفترة وجيزة. بعد هذه الخطوة إذا رغبت في ذلك ، أضف مركبات إضافية (أي 1 ميكرومتر رابامايسين). إذا تم ذلك ، فقم بالدوامة لفترة وجيزة بعد ماصة كل مادة إضافية إلى الأنبوب. ضع الأنابيب مرة أخرى على طاولة التسخين لمنع التصلب المبكر. 
	ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 800 ميكرولتر.</li>
</ol>
3. تحضير شرائح المجهر التي تحتوي على وسادات تجويع
<ol>
	<li>ماصة 140 ميكرولتر من محلول الاغاروز في تجويف شريحة المجهر (التي لا تزال موجودة على لوحة التسخين). حاول تجنب صنع الفقاعات إن أمكن.</li>
	<li>ضع على الفور غطاء على محلول الاغاروز. 
	ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى سطح مستو.</li>
	<li>ضع شريحة المجهر على مقعد المختبر لمدة 4 دقائق تقريبا للسماح لوسادة الاغاروز بالتصلب.</li>
	<li>قم بإزالة الغطاء بعناية من وسادة الاغاروز عن طريق تحريكه بمساعدة الإبهام أو السبابة (ارتد قفازات لتجنب التلوث!).</li>
	<li>ضع شريحة المجهر مع الوسادة في غرفة مبللة لمنع الجفاف. التوصية: استخدم صندوق طرف فارغ لا يزال يحتوي على ملحق لتثبيت أطراف الماصة. أضف الماء المعقم إلى الصندوق حتى يتم تغطية القاع. ضع شرائح المجهر على الملحق وأغلق الصندوق.</li>
</ol>
4. تلقيح ضمادات الجوع ب P. chrysogenum والحضانة
<ol>
	<li>ماصة 5 ميكرولتر من تخفيف الأبواغ 1/50 (إذا كانت المزارع نمت على الأرز) أو 5 ميكرولتر من المحلول غير المخفف الذي يحتوي على شظايا الفطريات (إذا نمت المزارع على صفيحة أجار) على وسط وسادة الجوع.</li>
	<li>أغلق الغرفة المبللة ولفها في كيس بلاستيكي (هذا بمثابة حماية إضافية ضد جفاف وسادات الجوع). احرص على عدم تحريك الصندوق كثيرا وإلا فسوف يتم إزعاج قطرات التلقيح.</li>
	<li>قم بتخزين الصندوق الملفوف في RT لمدة 20 ساعة على الأقل قبل تحليل العينات.</li>
</ol>
فئة 5. التحليل المجهري للعينات
<ol>
	<li>بعد 20 ساعة من الحضانة ، تكون العينات جاهزة للتحليل المجهري ؛ ضع شريحة المجهر على ورق مناديل جافة (يميل الجزء السفلي إلى أن يصبح رطبا).</li>
	<li>ماصة كمية صغيرة من الماء (حوالي 50 ميكرولتر) على وسادة الجوع. ضع غطاء على الوسادة واضغط على الماء الفائض. قم بإزالة الماء الفائض بالمناديل الورقية.</li>
	<li>ضع شريحة المجهر على طاولة المراقبة الخاصة بالمجهر الفلوري. للحصول على نظرة عامة على نمو الفطريات ، استخدم هدف 20X. استخدم أهداف 63X أو 100X لدراسة توطين GFP في الخيوطات. من أجل منع الجفاف التدريجي للعينة ، لا تحلل العينات لمدة تزيد عن 15 دقيقة قبل إعادتها إلى الغرفة الرطبة.</li>
	<li>كرر 5.3 على فترات منتظمة (على سبيل المثال ، بعد 40 ساعة و 60 ساعة من النمو). 
	ملاحظة: يمكن إعادة العينة إلى الغرفة الرطبة. ليس من الضروري إزالة الغطاء لأنه لا يؤثر على نمو الفطريات.</li>
</ol>

<ol><li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control%3A+an+integrated+network+of+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li>
<li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina%3A+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li>
<li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li>
<li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li>
<li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li>
<li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li>
<li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding%2C+improving+and+using+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li>
<li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li>
<li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).</li>
</ol>

المؤلف ليس لديه ما يفصح عنه.

تسمح الطريقة المعروضة هنا بدراسة مريحة وقابلة للتكرار للالتهام الذاتي في P. chrysogenum. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لفحص فعالية المركبات المختلفة سواء كانت قادرة على تعديل استجابة الالتهام الذاتي لهذه الفطريات أم لا. توضح النتائج مع الرابامايسين أن تثبيط إشارات TOR يؤدي إلى تحريض واضح للالتهام الذاتي في P. chrysogenum والذي تم إثباته أيضا للكائنات الحية الأخرى 11.
من الممكن استخدام الفطريات المزروعة على منصات الجوع لتحليلها في مجاهر أكثر تطورا (على سبيل ال...

الفطريات الخيطية هي أنظمة نموذجية ممتازة لدراسة العمليات التنموية. أنها توفر العديد من الفوائد التجريبية مثل الزراعة الرخيصة والأعداد الكبيرة من النسل وإمكانية الوصول الجيني. النقطة الأخيرة ذات أهمية خاصة لبناء المحولات التي تسمح بالتحقيق في أهمية الجينات غير المميزة حتى الآن للآليات الخلوية المختلفة. لعبت الفطريات الخيطية دورا أساسيا في توضيح العديد من عناصر وآليات مسارات مراقبة الجودة الخلوية مثل نشاط البروتياز لتدهور البروتينات الشاذة ، وديناميكيات الميتوكوندريا للحفاظ على سلامة الميتوكوندريا والالتهام الذاتي لإزالة مكونات الخلايا الفائضة و / أو المختلة وللحفاظ على بقاء الخلية في أوقات الجوع1،2،3.
هناك العديد من التقنيات التجريبية المتاحة لدراسة الالتهام الذاتي في الفطريات الخيطية 2: (أنا) التحقيق في الفجوات إذا كانت تحتوي على أجسام ذاتية كثيفة عندما يتم تثبيط البروتياز عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال 4 ، (ثانيا) تصور البلعمة الذاتية عن طريق مراقبة بؤر GFP-Atg8 عبر المجهر الفلوري 5،6 و (ثالثا) الكشف عن الهياكل الذاتية المحمضة باستخدام صبغة الفلورسنت monodansyl cadaverine 7.
هنا ، يتم تقديم طريقة جديدة لزراعة Penicillium chrysogenum لدراسات الالتهام الذاتي. العنصر الرئيسي هو "وسادة الجوع" التي تتكون ببساطة من 1٪ من الاغاروز المذاب في ماء الصنبور المعقم. يمكن إضافة مركبات إضافية (على سبيل المثال ، الضغوطات ، والزبالون ، ومعدلات الالتهام الذاتي) إلى الوسادة طالما أنها لا تعرض التألق التلقائي. توجد الوسادة في شرائح مجهرية تحتوي على تجويف مركزي ضحل. يتم تلقيح هذه الوسادة إما بتعليق بوغ أو بشظايا فطريات صغيرة. ينصح بهذا الأخير إذا فشلت سلالة الاهتمام في التكاثر بكفاءة (على سبيل المثال ، Δatg1 سلالات 8). يتم وضع الشرائح في غرف مبللة (يمكن إنشاؤها بسهولة باستخدام صناديق أطراف الماصة الفارغة) لمنع جفاف العينة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة. P. chrysogenum قادر على النمو لبضعة أيام في ظل هذه الظروف. يمكن ملاحظة الالتهام الذاتي مجهريا عن طريق تضخم الفراغ وهو علامة إيجابية للالتهام الذاتي الفطري. في هذه المساهمة ، P. الأحجار الكريمة يتم استخدام سلالة الكريسوجين (ويسكونسن 54-1255) التي تشكل بروتين فلوري أخضر يستهدف البيروكسيسومات من خلال تسلسل "SKL" الطرفي C 9. لذلك من الممكن مراقبة تدهور البيروكسيسومات. من الممكن أيضا تسمية مقصورات أخرى من الخلية (مثل الميتوكوندريا) باستخدام إشارات التوطين المناسبة وتحليل تدهورها. على الرغم من أن البيانات من P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) معروضة هنا ، فمن الممكن بالتأكيد استخدام طريقة "وسادة الجوع" أيضا للفطريات الخيطية الأخرى (على سبيل المثال ، Neurospora crassa و Sordaria macrospora و أنواع Aspergillus وما إلى ذلك).

<table><tbody><tr><td>شرائح مجهرية مع تجويف مركزي</td><td>Carl Roth GmbH ، كارلسروه ، ألمانيا</td><td>H884.1</td><td>يمكن استخدامها عدة مرات بعد التنظيف.</td></tr><tr><td>الخرز الزجاجي</td><td>Carl Roth GmbH ، كارلسروه ، ألمانيا</td><td>A553.1</td><td>القطر: 0.25 - 0.50 مم</td></tr></tbody></table>

تحليل الالتهام الذاتي في<em&gt; البنسليوم العسجدية</em&gt; باستخدام التجويع وسادات في تركيبة مع المجهر مضان

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

برزت دراسة أنظمة مراقبة الجودة الخلوية كمجال ديناميكي للغاية وملائم للبحث المعاصر. لقد أصبح من الواضح أن الخلايا تمتلك عدة خطوط دفاع ضد الأضرار التي تلحق بالجزيئات ذات الصلة بيولوجيا مثل الأحماض النووية والدهون والبروتينات. بالإضافة إلى ديناميكيات العضيات (الاندماج / الانشطار / الحركة / الوراثة) ونشاط البروتياز الذي يتم التحكم فيه بإحكام ، فإن تدهور العضيات الفائضة أو التالفة أو المعرضة للخطر عن طريق الالتهام الذاتي ("الأكل الذاتي" الخلوي) قد حظي باهتمام كبير من المجتمع العلمي. تنظيم الالتهام الذاتي معقد للغاية ويعتمد على العوامل الوراثية والبيئية ، والتي لم يتم توضيح الكثير منها حتى الآن. هنا يتم تقديم طريقة جديدة تسمح بدراسة مريحة للالتهام الذاتي في الفطريات الخيطية Penicillium chrysogenum. يعتمد على نمو الفطريات على ما يسمى ب "منصات الجوع" لتحفيز الالتهام الذاتي بطريقة قابلة للتكرار. يتم فحص العينات مباشرة عن طريق الفحص المجهري وتقييمها لتحريض / تقدم الالتهام الذاتي. لا يقتصر البروتوكول المقدم هنا على الاستخدام مع P. chrysogenum ويمكن تكييفه بسهولة للاستخدام في الفطريات الخيطية الأخرى.

لإثبات فائدة البروتوكول المفصل أعلاه، تم تحليل تحلل البيروكسيسومات في سلالة P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL). في هذه السلالة، يتم عادةً استيراد GFP-SKL إلى البيروكسيسومات 9، مما يؤدي إلى ظهور أشكال كروية متعددة عند تحليل العينة بواسطة المجهر الفلوري. وإذا حدث الالتهام الذاتي، تتوسع الفجوات، حيث يندمج GFP-SKL في الفجوات عن طريق الالتهام الذاتي (الالتهام البيروكسيسومي/pexophagy). ونظراً لأن البروتين GFP مقاوم للتحلل بواسطة بروتياز الفجوة، فإنه يعمل على وسم هذه العضيات 10. وبناءً على ذلك، يم...

طريقة مريحة وقوية لدراسة الالتهام الذاتي في Penicillium chrysogenum باستخدام وسادات الجوع (مخاليط من الاغاروز وماء الصنبور في شريحة مجهرية تحتوي على تجويف مركزي) يتم تقديمها هنا.

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

الهدف من هذا الإجراء هو تحفيز ومراقبة عملية الالتهام الذاتي في فطر خيطي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تلقيح أحجام صغيرة من وسط يحتوي على مواد مغذية بالأبواغ أو بقطع صغيرة من الغزل الفطري. وفي الخطوة الثانية، يتم تحضير وسادات تجويع في فجوات شرائح مجهرية زجاجية، ثم يُنقل اللقاح إلى هذه الوسادات.في الخطوة النهائية، تُحضن وسادات التجويع في غرفة رطبة لتحفيز عملية الالتهام الذاتي. وفي نهاية المطاف، يمكن تتبع الالتهام الذاتي عن طريق مراقبة انتقال بروتينات العلامات الفلورية المستهدفة إلى الفجوات باستخدام المجهر الفلوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة القضايا الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية، مثل تحديد مركبات جديدة تضبط عملية الالتهام الذاتي.للتحضير لتجربة التجويع، إذا كانت سلالة P cresa genum المطلوبة محفوظة على الأرز الأخضر، ضع أولاً حبتين إلى ثلاث حبات من الأرز المغطاة بالميسيليا في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 µL، واملأ الأنبوب بـ 500 µL من وسط نمو مستخلص الخميرة والجلوكوز أو وسط GG. ثم قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الفورتكس لمدة 30 ثانية حتى تنفصل الأبواغ عن الأرز، واحفظ الأنبوب لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة. وفي اليوم التالي، خفف معلق الأبواغ إلى تركيز 1:50 في ماء صنبور معقم واخلطه جيداً، أما إذا كانت p cryogen محفوظة على الآجار.استخدم رأس ماصة لنقل قطع صغيرة من الميسيليوم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 400 µL من مياه الصنبور المعقمة وحوالي 100 mg من الخرز الزجاجي. بعد ذلك، قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الفورتكس لمدة دقيقتين حتى يتجزأ الميسيليوم. لزراعة PCE genum على وسادة تجويع، قم أولاً بتسخين اللوح الساخن إلى حوالي 60 °C.بعد ذلك، يتم إذابة جرامين من aros في 100 milliliters من ماء الصنبور في الميكروويف حتى يصبح المحلول الناتج رائقاً تماماً، مع ترك aros ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة 60 degrees Celsius تقريباً. يتم ملء أنبوب micro centri بقيمة 1.5 milliliter لكل عينة بـ 400 microliters من ماء صنبور معقم أو محلول مركب. ثم تُسخن الأنابيب وشرائح المجهر على لوح التسخين لمدة 60 seconds على الأقل.انقل 400 µL من الـ aros بدرجة حرارة 60 °C إلى جميع الأنابيب، ليصل الحجم الإجمالي في كل أنبوب إلى 800 µL، ثم قم برج الأنابيب باستخدام جهاز الفورتكس لفترة وجيزة، وبعد ذلك أعد الأنابيب إلى لوحة التسخين لمنع التصلب المبكر. الآن، اسحب 140 µL من محلول aros المناسب بواسطة الماصة وضعها في تجويف كل شريحة مجهرية. مع الحرص على عدم تكوين فقاعات، قم بتسطيح الـ aros فوراً باستخدام أغطية الشرائح، ثم اترك الشرائح لترتاح لمدة أربع دقائق تقريباً.عند درجة حرارة الغرفة، وبمجرد أن تتصلب وسائد الأغار، استخدم الإبهام أو السبابة لإزالة شرائح التغطية بعناية، ثم ضع الشرائح المجهرية والوسائد في غرفة رطبة. بعد ذلك، انقل خمسة ميكرولتر 5 µL من مستنبت P er genum الذي تم تحضيره مسبقاً باستخدام الماصة إلى مركز وسادة التجويع، ثم غلف الغرفة الرطبة بكيس بلاستيكي لتوفير حماية إضافية ضد الجفاف، مع الحرص على عدم تحريك الصندوق كثيراً أو إزعاج المزارع. ثم خزن اللقاحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 ساعة على الأقل قبل تحليل العينات.في اليوم التالي، انقل الشرائح إلى ورق نشاف جاف، ثم وزع 50 µL من الماء على كل وسادة تجويع. استخدم غطاء شريحة لإخراج الماء الزائد لإزالته باستخدام ورق نشاف نظيف. بعد ذلك، وبالنسبة لكل شريحة، استخدم عدسة شيئية بقوة 20x للحصول على نظرة عامة لنمو الغزل الفطري.لتقييم تموضع الـ GFP في الـ Hy-Fi. افتح الصور باستخدام العدسة الشيئية 63 x أو 100 x. وأخيراً، أعد الشرائح إلى الغرفة الرطبة بعد كل عملية فحص حتى موعد التجربة التالي.توضح هذه الصور أنه تم استخدام سلالة G-F-P-S-K-L-P Creo Genum لتقييم تحلل البيروكسيسومات بعد 20 ساعة من الحضن. لم يُلاحظ وجود GFP في الفجوات العصارية، كما لم تكن تلك العضيات متضخمة. ومع ذلك، عند 40 ساعة من النمو، أمكن رؤية فجوات عصارية مُعلمة بـ GFP في بعض الخيوط الفطرية، مما يشير إلى تفعيل عملية الالتهام الذاتي، مع ملاحظة استمرار تألق GFP وتضخم الفجوات العصارية عند 60 ساعة.في هذه التجربة، تم استخدام طافر delta 80 G من سلالة p caressa Genum كضابط سلبي. يلاحظ عدم حدوث تضخم في الفجوات العصارية وغياب الـ GFP، حتى بعد 60 ساعة من النمو، كما هو ملاحظ في سلالة G-F-P-S-K-L غير المعالجة. أما كضابط إيجابي، فقد تم استخدام دواء rapamycin المحفز للبلعمة الذاتية؛ حيث أصبحت الفجوات العصارية الموّسمة بـ GFP مرئية بعد 40 ساعة من النمو، بينما امتلأت الـ Hy-Fi بالكامل بفجوات عصارية ضخمة تحتوي على GFP بحلول الساعة 60.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل عملية الالتهام الذاتي في الفطريات التي تصيب العقل (mentis fungi).

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ووصف نهج قوي لمراقبة تسليم العضيات لمعة الحامضية للفجوة الخميرة للتحلل وإعادة التدوير. الأسلوب يعتمد على وضع العلامات المحددة الهدف العضيات مع مضان المزدوجة الانبعاثات المرمزة وراثيا الحموضة ، جهاز الاستشعار البيولوجي ، والتصور من الخلايا الفردية باستخدام المجهر مضان.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

الالتهام الذاتي هو عملية في كل مكان التي تمكن الخلايا تتحلل وإعادة تدوير البروتينات والعضيات. نحن نطبق المجهري مضان متقدمة لتصور وقياس صغيرة، ولكن التغييرات الأساسية، المادية المرتبطة تحريض الالتهام الذاتي، بما في ذلك تشكيل وتوزيع autophagosomes والجسيمات الحالة، والانصهار بهم إلى autolysosomes.

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

الوقت الفاصل بين المجهري من علامات الالتهام الذاتي fluorescently المسمى يسمح رصد استجابة الالتهام الذاتي ديناميكية مع القرار الزماني عالية. باستخدام الالتهام الذاتي محددة وعلامات عضية في مزيج من 3 ألوان مختلفة، ونحن يمكن أن يتبع مساهمة بروتين لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في سياق المكاني والزماني قوية.

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

يمكن أن يتسبب الإنتان التجريبية في الفئران باستخدام ربط الأعور وثقب (CLP) الأسلوب. يتم عرض البروتوكولات الحالية لتقييم الالتهام الذاتي في الجسم الحي في سياق الإنتان CLP التي يسببها هنا: بروتوكول لقياس الالتهام الذاتي باستخدام الفئران (GFP) LC3، وبروتوكول لقياس تشكيل جسيم بلعمي ذاتي بواسطة المجهر الإلكتروني.

الأعور ربط والبزل التي يسببها تعفن الدم نموذجا لدراسة الالتهام الذاتي في الفئران

لمواجهة نشر الممرض، الخلايا المضيفة إعادة تنظيم الهيكل الخلوي لتجزئة البكتيريا وحمل الالتهام الذاتي. يتم تحديد العدوى عن طريق الشيجلا الخلايا زراعة الأنسجة، المضيف والمحددات الكامنة وراء هذه العملية الممرض وتتميز. باستخدام نماذج الزرد العدوى الشيجلا، يتم التحقيق في دور الجزيئات والآليات التي اكتشفت في الجسم الحي.

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

هنا، يستخدم قياس التدفق الخلوي المتعدد الأطياف مع ميزة تحليلية يقارن الصور التفصيلية المشرقة لثلاثة علامات للبلعمة الذاتية ويحدد مدى مشاركتها في التعريب، جنبا إلى جنب مع عد بقعة LC3، لقياس التلقيح الذاتي بطريقة موضوعية وكمية وإحصائية قوية.

تقييم التمويه الذاتي عن طريق قياس LC3، p62، و LAMP1 المشاركة في التعريب باستخدام قياس التدفق المتعدد الأطياف الخلوي

لقد قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات بيولوجية الخلية المستندة إلى تصوير fluorescence تجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك في الجهاز العصبي المركزي لنماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن.

بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج

هذه الورقة تفاصيل بروتوكول لإعداد ثقافة مشتركة من خلايا cryptococcal والأميبا التي يتم دراستها باستخدام الصور الفلورية لا يزال، والصور عالية الدقة نقل المجهر الإلكتروني. ويتضح هنا كيف يمكن للبيانات الكمية أن تكمل هذه المعلومات النوعية.

الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba

يصف هذا البروتوكول تحريض الالتهام الذاتي في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة عن طريق استنفاد المغذيات ويحلل التغيرات في الالتهام الذاتي باستخدام سلالات الذباب المعدلة وراثيا.

تحليل الالتهام الذاتي الناجم عن الجوع في الجسم الدهني ليرقات ذبابة الفاكهة

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد مستويات الالتهام الذاتي في سرطان البنكرياس وخلايا أسينار البنكرياس من خلال التألق المناعي LC3 والقياس الكمي لنقطة LC3.

تقييم مستويات الالتهام الذاتي في نموذجين مختلفين لخلايا البنكرياس باستخدام التألق المناعي LC3

هنا ، نقدم بروتوكولا للفحص المجهري الإلكتروني الضوئي المترابط على المقطع بناء على الملصقات الفلورية الداخلية كأداة للتحقيق في توطين البروتينات النادرة فيما يتعلق بالبنية الخلوية الفائقة. تتجلى قوة هذا النهج من خلال توطين البنية التحتية ل LC3 الداخلي في الخلايا الجائعة دون علاج بافيلوميسين.

توطين البنية التحتية ل LC3 الداخلي بواسطة المجهر الإلكتروني الضوئي المترابط في المقطع

اكتشف طريقة تحليل الالتهام الذاتي في البنسليوم العسجدية باستخدام سادات التجويع والمجهر المضان. تُمكّن هذه التقنية الباحثين من دراسة آليات الخلايا وتتبع البروتينات الفلورية في الفجوات.

تحليل الالتهام الذاتي في

استكشف المزيد من الفيديوهات