رواية القوة الذرية المجهر Biopanning استنادا لعزل مورفولوجيا الكواشف محددة ضد المتغيرات TDP-43 في الضموري العضلي الجانبي التصلب

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل كواشف متخصصة في الشكل المورفولوجي ضد البروتين الرابط للحمض النووي DNA لـ tar. يتواجد 43 متغيراً في مكتبة LS باستخدام تقنية راديو بانينج (radio panning) تعتمد على A FM ثنائية المرحلة. يتم تحقيق ذلك من خلال إخضاع مكتبة فاج متنوعة أولاً لجولات متعددة من البانينج السلبي ضد مستضدات غير مستهدفة باستخدام أنابيب مناعية.

يتم إجراء الفرز السلبي بالتتابع ضد ألبومين المصل البقري، وألفا-سينوكلين المتكتل، وأنسجة دماغ بشرية سليمة. وتتمثل الخطوة الثانية في إكمال عملية تحقق باستخدام مجهر الفلورسنت (FM) بعد كل مجموعة من عمليات الفرز السلبي لضمان الإزالة الناجحة لجميع العاثيات غير المرغوب فيها. وفي هذا المثال الخاص بالفرز السلبي باستخدام ألفا-سينوكلين المتكتل، تكون العاثيات مرئية بعد جولة واحدة، ولكنها تختفي بعد الجولة العاشرة.

بعد ذلك، يتم إجراء جولات الفرز السلبي المتبقية على MICA نظراً لمحدودية توفر العينات. حيث تُزال الفاجات المتفاعلة مع TDP 43 المرسب مناعياً من أنسجة الأصحاء ومن أنسجة الخرف الجبهي الصدغي أو FTD بشكل متتابع. وتتمثل الخطوة النهائية في عزل الفاجات التي ترتبط بـ a LS المرسب مناعياً.

يتم استخلاص TDP 43 باستخدام العاثيات المرتبطة بالميكا عن طريق التريبسين، وثلاثي إيثيل الأمين، وخلايا TG one. وفي النهاية، يتم التحقق من خصوصية مستنسخات a LS المحتملة هذه باستخدام تقنيات indirect fa eliza's وdot blots، حيث يتم تثبيت أنسجة الدماغ البشري السليمة وأنسجة A-L-S-F-T-D المتجانسة في كلا الاختبارين. وعادة ما يتم اكتشاف تفاعلية أكبر تجاه أنسجة a LS مقارنة بالمجموعات الأخرى المختبرة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بطريقة الفرز الحيوي التقليدية باستخدام العاثيات في استخدام بروتوكولات فرز سلبي شاملة يتم التحقق منها بواسطة مجهر القوة الذرية (FM) لضمان عزل الكواشف التي تتعرف انتقائيًا على متغيرات بروتينية محددة للمرض مباشرة من عينات بيولوجية معقدة، حتى في حالة وجودها بتركيزات منخفضة. وعلى الرغم من أن مجهر القوة الذرية (FM) يمكن أن يوفر رؤية متعمقة في استقصاء السمات الجزيئية الحيوية والتفاعلات، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضًا في أنظمة أخرى مثل مراقبة تقدم عملية الفرز الحيوي وتأكيد خصوصية روابط أولغومرية حلقية (CLOs) مفردة. ابدأ هذا الإجراء بإنتاج العاثيات كما هو مفصل في البروتوكول النصي لإجراء الفرز السلبي ضد BSA أولاً، ثم أضف 4 mL بتركيز 1 mg/mL.

أضف محلول BSA في محلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS إلى 12 أنبوب مناعة واتركها لتحضن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، ادمج جسيمات العاثيات من كل من المكتبات الثلاث، مع تجنيب كمية صغيرة من خليط العاثيات هذا للتحقق المستقبلي من عملية الفرز السلبي (negative panning). ثم تخلص من محلول BSA من الأنبوب الأول واغسل الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة أي BSA غير مرتبط، وأضف مكتبات العاثيات المدمجة إلى هذا الأنبوب الأول، واتركها لتحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على جهاز الدوار (rotator) قبل جمع العاثيات غير المرتبطة.

ضع في اعتبارك أنه من المهم الاحتفاظ بكمية صغيرة من العاثيات (phage) بعد الانتهاء من الجولات المتعددة من الغربلة السلبية (negative panning) ضد كل هدف، وذلك للتحقق من نجاح عملية الغربلة، وفي حالة حدوث تلوث، يتم تكرار عملية الغربلة السلبية باستخدام الأنابيب المتبقية من محلول BSA في كل مرة. استخدم العاثيات غير المرتبطة التي تم جمعها بعد تحضين الأنبوب السابق. ثم تحقق من إزالة جميع العاثيات المرتبطة بـ BSA باستخدام إجراء A FM المفصل في القسم التالي من الفيديو.

لتصور ارتباط العاثيات باستخدام مجهر القوة الذرية (FM)، أضف 10 إلى 20 µL من المستضد المستهدف إلى الميكا المنقاة واتركها للحضانة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. اغسل الميكا خمس مرات بالماء، ثم أضف 10 إلى 20 µL من العاثيات إلى الميكا واتركها للحضانة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. اغسل الميكا خمس مرات أخرى بالماء واتركها لتجف في الهواء.

قم بإجراء عملية التصوير باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) بنمط النقر (tapping mode) باستخدام جهاز NanoScope III ووحدة تحكم في الهواء عند درجة حرارة الغرفة. تتميز مجسات AFM المصنوعة من السيليكون بتردد رنين يبلغ 300 kilohertz وثابت نابض يبلغ 40 newton's per meter. أدخل رأس مجهر AFM في أداة تحميل الرؤوس.

قم بتركيب محمل السن في مجهر A FM. ضع العينة تحت مجهر A FM. استخدم مقابض الضبط لمحاذاة الليزر على سن مجهر A FM.

اضبط معدل المسح على 3.05 hertz ودقة المسح على 512 عينة لكل خط. قم بإجراء الضبط التلقائي (Auto-Tune) للجهاز لتحسين اهتزاز السيليكا وتردد السن، ثم ابدأ في مسح العينة.

سيقوم الرأس بمسح سطح ميكا (MICA) لقياس ارتفاع العاثيات المرتبطة. تظهر العاثيات كخطوط بيضاء طويلة؛ وبعد عملية الاستحواذ، يتم معالجة الصور عن طريق تسوية الخلفية الأساسية لضمان إمكانية مقارنة جميع أحجام الجسيمات داخل كل صورة. قد يختلف عرض العاثية من صورة إلى أخرى بسبب أحجام الجسيمات الأخرى ومساحة المسح، ولكن هذا لن يؤثر أبدًا على دقة تحديد ما إذا كانت العاثية قد ارتبطت بالمستضد أم لا.

يتم تحويل الصورة إلى صورة ثنائية الأبعاد (2D image)، ويتم تحديد المناطق التي تظهر فيها جودة التصوير ضعيفة بسبب تلوث PEG لضمان استبعادها من تحليلات البيانات المستقبلية. يتم إجراء الترسيب المناعي لبروتين TDP 43 السليم من أنسجة دماغ بشرية سليمة كما هو موضح في البروتوكول النصي، وذلك نظراً لانخفاض كمية البروتين المترسب مناعياً. تُجرى جولات الفرز السلبي (negative panning) باستخدام MICA أولاً؛ حيث يتم إضافة 100 µL تقريباً من البروتين المترسب مناعياً إلى الأسطح الثمانية لـ MICA عند السطح الأول من MICA، ثم تُحضن لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد عملية التحضين.

اغسل الـ MICA خمس مرات باستخدام محلول phosphate buffered saline مع tween 20 بتركيز 0.1%، والمختصر بـ PBST. ثم أضف حوالي 100 µL من العاثية (phage) بعد عملية الفرز السلبي (negative panning) ضد أنسجة دماغ بشرية سليمة، واتركها لتحضن لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وفي منتصف فترة التحضين، أضف البروتين المرسب مناعياً (immuno precipitated protein) إلى شريحة mica الثانية.

اجمع العاثية من شريحة MICA الأولى قبل غسل شريحة MICA خمس مرات باستخدام 0.1%PBST. بعد غسل شريحة الميكا الثانية، أضف العاثية التي تم جمعها سابقاً. كرر العملية بأكملها حتى يتم إجراء فرز سلبي (negative panning) للعاثية مقابل جميع شرائح الميكا الثماني التي تحتوي على البروتين المرسب مناعياً.

تحقق من نجاح عملية الغربلة (panning) باستخدام العاثية (phage) بعد الجولتين الأولى والثامنة من الغربلة السلبية باستخدام FM لبدء الترسيب المناعي لبروتين TDP 43 من أدمغة الأفراد المصابين بـ LS كما هو موضح في البروتوكول النصي، ثم قم بقطع ثلاثة أسطح من MICA. بعد ذلك، أضف 50 microliters من A LS TDP 43 إلى أول MICA بعد تحضين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل MICA خمس مرات باستخدام 0.1%PBST.

بعد ذلك، أضف 50 µL من العاثيات التي تم جمعها بعد عملية الفرز السلبي ضد TDP 43 السليم إلى MICA واتركها لتحضن لمدة خمس دقائق. اجمع العاثيات غير المرتبطة. من المهم الحفاظ على فصل جميع العاثيات التي تم جمعها في خطوات الفرز هذه.

بعد ذلك، يتم جمع العاثيات المرتبطة باستخدام ثلاث طرق لاستخلاصها. أولاً، أضف 50 µL من التريبسين إلى كل MICA واحضنها لمدة لا تزيد عن 10 دقائق. ثم اجمع المحلول واحفظه.

بعد ذلك، أضف 50 µL من triethylamine بتركيز 100 mM إلى كل MICA واحضنها لمدة لا تزيد عن 10 دقائق. اجمع المحلول في حجم مساوٍ من tris HCL buffer بتركيز 1 M و pH 7.4 واحفظه، ثم أضف 50 µL من خلايا TG one مباشرة إلى MICA واحضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. كذلك، أضف العاثيات (phages) التي تم جمعها من طريقتي الاستخلاص الأوليين إلى 100 µL من خلايا TG one بنفس التركيز واحضنها لمدة 30 دقيقة عند 37 °C.

بعد ذلك، كرر هذه العملية باستخدام شريحة ميكا ثانية. خذ العاثيات غير المرتبطة التي تم جمعها باستخدام شريحة الميكا الأولى مع A LST DP 43 وأضفها إلى شريحة الميكا الثانية مع A-A-L-S-T-D-P 43 ثم حضنها لمدة خمس دقائق. ادمج خلايا TG one المصابة بالعاثيات، والمعالجة بالتريبسين من كل شريحة ميكا A LST DP 43، وازرعها في أطباق luria burani auger تحتوي على الأمبيسيلين أو أطباق LBA.

كرر العملية نفسها لكل من الفاجات triethyl amine وTG one من المجموعتين من A LS TDP 43 MICA ليكون المجموع ثلاث أطباق. كرر جميع الخطوات مع شريحة A LS mica ثالثة، ولكن في هذه الحالة، استخدم فاجات تم جمعها بعد جولتين من الفرز السلبي (negative panning) ضد TDP 43 plate لمرض الخرف الجبهي الصدغي. ازرع خلايا TG one المصابة على ثلاثة أطباق LBA واحضنها طوال الليل عند 37 درجة Celsius.

في اليوم التالي، قم بعدد المستعمرات الموجودة على أطباق LBA الستة التي تحتوي على مستنسخات ALS محتملة. يجب أن يكون عدد المستعمرات في أطباق LBA الثلاثة الناتجة عن جولة MICA الثالثة لـ ALS أقل مقارنة بأطباق LBA الثلاثة بعد جولتين من الغربلة الإيجابية باستخدام العاثيات بعد الغربلة السلبية ضد بروتينات TDP 43 السليمة. قم بإنتاج العاثيات وشظايا الأجسام المضادة من نطاق المتغير أحادي السلسلة الذائب أو scvs من هذه المستنسخات، وحللها باستخدام مقايسات مناعية مختلفة للتحقق من النوعية تجاه أنسجة ALS.

يُستخدم تصوير FM لمراقبة خطوات الغربلة السلبية (negative panning) ضد الأهداف المختلفة لضمان إزالة جميع العاثيات التفاعلية. وأظهرت نتائج FM ارتباط العاثيات بعد جولة واحدة من الغربلة السلبية ضد بروتين alpha synuclein المتجمع، وعدم وجود ارتباط بعد ثماني جولات. كما أُجريت غربلة سلبية ضد أنسجة دماغ بشرية سليمة لإزالة العاثيات التي ترتبط بالعديد من المستضدات الموجودة في متجانس الدماغ البشري السليم.

يوضح الشكل هنا ارتباط العاثيات (phage) بالأنسجة السليمة بعد جولة واحدة من الفرز السلبي (negative panning)، وعدم وجود عاثيات مرتبطة بعد 10 جولات من الفرز السلبي. بعد تحضير كل من العاثيات و SCFE الذائب من المستنسخات المحتملة، تم اختبارها باستخدام مقايسة Eliza غير المباشرة لتحديد النوعية تجاه أنسجة LS. وأظهرت جميع العاثيات تقريباً تفضيلاً لأنسجة LS على الأنسجة السليمة.

تم الحصول على نتائج مماثلة عند مقارنة ارتباط العاثية بنسيج LS مقابل نسيج الخرف الجبهي الصدغي أو FTD. وقد أظهرت مقارنة ارتباط SCFV بنسيج LS في كل من الأنسجة السليمة وأنسجة FTD مرة أخرى ارتباطاً انتقائياً بنسيج LS في جميع المستنسخات تقريباً. استُخدم مقايسة اللطخة النقطية المناعية لمزيد من التحقق من الارتباط بنسيج LS وأيضاً لتحديد المستنسخات التفاعلية في التطبيقات المناعية الأخرى.

يظهر هنا ارتباط المستنسخ two a بنسيج LS. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق عمليةPanning حيوي تعتمد على FM لعزل كواشف ضد أهداف اهتمام محددة للمرض، وهي كواشف قد تكون بمثابة أدوات تشخيصية و/أو علاجية محتملة.