رواية القوة الذرية المجهر Biopanning استنادا لعزل مورفولوجيا الكواشف محددة ضد المتغيرات TDP-43 في الضموري العضلي الجانبي التصلب

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الكواشف المحددة للمورفولوجيا ضد بروتين ربط الحمض النووي بالقطران. 43 متغيرا موجودا في LS باستخدام تقنية التحريك الراديوي القائمة على FM على مرحلتين. يتم تحقيق ذلك من خلال إخضاع مكتبة العاثيات المتنوعة أولا لجولات متعددة من التحريك السلبي ضد المستضدات غير المستهدفة باستخدام الأنابيب المناعية.

يتم إجراء التحريك السلبي بالتتابع ضد ألبومين مصل الأبقار ، وألفا سينوكلين المجمعة وأنسجة المخ البشرية السليمة. الخطوة الثانية هي إكمال التحقق من FM بعد كل مجموعة من التحريك السلبي لضمان الإزالة الناجحة لجميع العاثيات غير المرغوب فيها. في مثال التحريك السلبي هذا ، يكون استخدام عاثيات ألفا سينوكلين المجمعة مرئية بعد جولة واحدة ، ولكنها غائبة بعد الجولة العاشرة.

بعد ذلك، يتم تنفيذ جولات التحريك السلبية المتبقية على MICA نظرا لتوفر العينة المحدود. تتم إزالة العاثيات التفاعلية مع TDP 43 المترسب المناعي من الأنسجة السليمة ومن الخرف الجبهي الصدغي أو أنسجة FTD بالتتابع. الخطوة الأخيرة هي عزل العاثيات التي ترتبط ب LS المناعي المترسب.

يتم التلميح إلى TDP 43 باستخدام العاثيات المرتبطة بالميكا باستخدام خلايا التربسين وثلاثي الإيثيل والأمين و TG واحد. في النهاية ، يتم التحقق من خصوصية هذه الإمكانات ، يتم التحقق من استنساخ LS باستخدام بقع fa eliza و dot غير المباشرة ، ومتجانسة A-L-S-F-T-D وأنسجة الدماغ البشرية السليمة في كلا المقايسين. عادة ما يتم الكشف عن تفاعل أكبر مع أنسجة LS مقارنة بالمجموعات الأخرى المختبرة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التحريك الحيوي التقليدي للعاثيات في استخدام بروتوكولات التحريك السلبية الشاملة التي تم التحقق منها بواسطة FM لضمان عزل الكواشف التي تتعرف بشكل انتقائي على متغيرات البروتين الخاصة بالمرض مباشرة من العينات البيولوجية المعقدة ، حتى عند وجودها بتركيزات منخفضة. على الرغم من أن FM يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة للتحقيق في الميزات الجزيئية الحيوية والتفاعلات ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا في أنظمة أخرى مثل مراقبة تقدم الكتابة الحيوية وتأكيد خصوصية CLOs الفردية. ابدأ هذا الإجراء بإنتاج العاثيات كما هو مفصل في بروتوكول النص لإجراء التحريك السلبي ضد BSA أولا ، أضف أربعة ملليلتر من مليغرام واحد لكل مليلتر.

محلول BSA في محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS إلى 12 أنبوبا مناعيا ويحتضن طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اجمع بين جزيئات العاثيات من كل مكتبة من المكتبات الثلاث ، مع تخصيص كمية صغيرة من خليط العاثيات هذا للتحقق المستقبلي من عملية التحريك السلبية. ثم تخلص من محلول BSA من الأنبوب الأول واغسل الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة أي BSA غير مرتبط ، أضف مكتبات العاثيات المدمجة إلى هذا الأنبوب الأول ، واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على المدور قبل جمع العاثيات غير المرتبطة.

ضع في اعتبارك أنه من المهم حفظ كمية صغيرة من العاثية بعد الانتهاء من الجولات العديدة من التحريك السلبي ضد كل هدف للتحقق من نجاح عملية التحريك وفي حالة التلوث ، كرر عملية التحريك السلبية مع الأنابيب المتبقية من محلول BSA في كل مرة. استخدم العاثية غير المنضمة التي تم جمعها بعد حضانة الأنبوب السابق. ثم تحقق من إزالة جميع مجلدات العاثيات BSA باستخدام إجراء A FM المفصل في القسم التالي من الفيديو.

لتصور ارتباط العاثية باستخدام FM ، أضف 10 إلى 20 ميكرولترا من المستضد المستهدف للشق والميكا واحتضانه لمدة خمس إلى 10 دقائق. اغسل MICA خمس مرات بالماء ، ثم أضف 10 إلى 20 ميكرولترا من العاثيات إلى MICA واحتضنه لمدة خمس إلى 10 دقائق. اغسل الميكا خمس مرات أخرى بالماء واتركها حتى تجف في الهواء.

قم بتنفيذ عملية تصوير FM باستخدام وضع التنصت FM مع منظار نانو ثلاثة ، وحدة تحكم في الهواء في درجة حرارة الغرفة. السيليكون مجسات FM لها تردد رنين يبلغ 300 كيلو هرتز وثابت زنبركي يبلغ 40 نيوتن لكل متر. أدخل طرف FM في اللودر الطرفي.

قم بتوصيل اللودر الطرفي بمجهر A FM. ضع العينة تحت مجهر A FM. استخدم المقابض لمحاذاة الليزر على طرف A FM.

اضبط معدل المسح الضوئي على 3.05 هرتز ودقة المسح الضوئي على 512 عينة لكل سطر. ضبط الماكينة تلقائيا لتحسين اهتزاز السيليكا. تردد الطرف ، ابدأ مسح العينة.

سيقوم الطرف بمسح سطح MICA لقياس ارتفاع العاثية المقلدة. العاثيات هي الخطوط البيضاء الطويلة التي تتبع عملية الاستحواذ على الصور عن طريق التسطيح الأساسي للخلفية للتأكد من أن جميع أحجام الجسيمات قابلة للمقارنة داخل كل صورة. قد يختلف عرض العاثية من صورة إلى أخرى بسبب أحجام الجسيمات الأخرى ومنطقة المسح ، ولكنه لن يضر أبدا بدقة ما إذا كانت العاثية مرتبطة بالمستضد أم لا.

يتم تسطيح الصورة إلى صورة ثنائية الأبعاد ويتم تمييز المناطق المصورة بشكل سيئ الناتجة عن تلوث PEG لإزالتها من تحليل البيانات المستقبلي. يترسب المناعة بروتين TDP 43 الصحي من أنسجة المخ البشرية السليمة كما هو موضح في بروتوكول النص بسبب انخفاض كمية البروتين المترسب المناعي. قم بإجراء هذه الجولات من التحريك السلبي باستخدام MICA أولا ، قم بشق ثمانية أسطح MICA إلى MICA الأول عند حوالي 100 ميكرولتر من البروتين المترسب المناعي واحتضانه لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة.

اغسل MICA خمس مرات بمحلول ملحي مخزن 0.1٪ فوسفات مع 20 PBST مختصر. ثم أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر من العاثية بعد التحريك السلبي ضد أنسجة المخ البشرية السليمة واحتضانها لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في منتصف الحضانة ، أضف البروتين المترسب المناعي إلى الميكا الثانية.

اجمع العاثية من MICA الأول قبل غسل MICA خمس مرات باستخدام 0.1٪ PBST. بعد غسل الميكا الثانية ، أضف العاثية التي تم جمعها مسبقا. كرر العملية برمتها حتى يتم تحريك العاثية سلبا ضد جميع الميكا الثمانية مع البروتين المترسب المناعي.

تحقق من نجاح عملية التحريك باستخدام العاثية بعد الجولات الأولى وثماني من التحريك السلبي باستخدام FM لبدء بروتين TDP 43 المناعي من أدمغة الأفراد المصابين ب LS كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بشق ثلاثة أسطح MICA. ثم أضف 50 ميكرولترا من A LS TDP 43 إلى MICA الأول بعد حضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل MICA خمس مرات باستخدام 0.1٪ PBST.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من العاثية التي تم جمعها بعد التحريك السلبي ضد TDP 43 الصحي إلى MICA واحتضانها لمدة خمس دقائق. اجمع العاثيات غير المقيدة. من المهم إبقاء جميع العاثيات التي تم جمعها في خطوات التحريك هذه منفصلة.

بعد ذلك ، اجمع العاثيات المرتبطة باستخدام ثلاث طرق elucian. أولا ، أضف 50 ميكرولترا من التربسين إلى كل MICA واحتضنه لمدة لا تزيد عن 10 دقائق. اجمع الحل واحفظه.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من 100 مللي مولار ثلاثي إيثيل أمين إلى كل MICA واحتضنه لمدة لا تزيد عن 10 دقائق. اجمع المحلول بحجم متساو من الرقم الهيدروجيني المخزن المؤقت ثلاثي حمض الهيدروكلوريك 7.4 واحتفظ بالمركز الثالث ، أضف 50 ميكرولترا من خلية TG واحدة مباشرة إلى MICA واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أيضا ، أضف العاثيات التي تم جمعها من أول طريقتين إليوسيان إلى 100 ميكرولتر من خلية TG واحدة بنفس التركيز واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، كرر هذه العملية مع ميكا ثانية. خذ العاثية غير المنضمة التي تم جمعها باستخدام MICA الأول مع LST DP 43 وأضفها إلى MICA الثانية مع احتضان A-A-L-S-T-D-P 43 لمدة خمس دقائق. اجمع بين الخلايا المصابة بالعاثيات TG ، الملمح إلى التربسين من كل ميكا LST DP 43 ولوحة على جميع صفيحة المثقاب لوريا بوراني مع الأمبيسلين أو لوحة LBA.

كرر نفس العملية مع ثلاثي إيثيل أمين و TG واحد ألمح العاثيات من مجموعتين من LS TDP 43 MICA ليصبح المجموع ثلاث لوحات. كرر جميع الخطوات مع ميكا A LS ثالثة ، ومع ذلك ، في هذه الحالة ، استخدم العاثية التي تم جمعها بعد جولتين من التحريك السلبي ضد الخرف الجبهي الصدغي. لوحة T DP 43 TG المصابة خلية واحدة على ثلاث لوحات LBA وتحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي. احسب عدد المستعمرات على لوحات LBA الستة مع إمكانية استنساخ LS. يجب أن يكون هناك عدد أقل من المستعمرات على لوحات LBA الثلاثة من الميكا الثالثة A LS MICA مقارنة بألواح LBA الثلاثة بعد جولتين من التحريك الإيجابي باستخدام العاثية بعد التحريك السلبي ضد TDP 43 الصحي ينتج عاثيات وشظايا الأجسام المضادة ذات المجال المتغير أحادي السلسلة القابلة للذوبان أو s cvs من هذه المستنسخة وتحليلها باستخدام فحوصات مناعية مختلفة للتحقق من خصوصية أنسجة LS.

يتم استخدام تصوير FM لمراقبة خطوات التحريك السلبية مقابل الأهداف المختلفة لضمان إزالة جميع العاثيات التفاعلية. أظهرت نتائج FM ربط العاثيات بعد جولة واحدة من التحريك السلبي ضد سينوكلين ألفا المجمعة وعدم الارتباط بعد ثماني جولات. تم إجراء التحريك السلبي ضد أنسجة المخ البشرية السليمة لإزالة العاثيات التي ترتبط بالعديد من المستضدات الموجودة في تجانس الدماغ البشري السليم.

يظهر هنا ارتباط العاثيات بالأنسجة السليمة بعد جولة واحدة من التحريك السلبي ولم يتبق أي عاثية ملزمة بعد 10 جولات من التحريك السلبي. بعد تحضير كل من العاثية و SCFE القابلة للذوبان من المستنسخة المحتملة ، تم اختبارها في إليزا غير المباشرة للتأكد من خصوصيتها لأنسجة LS. أظهرت جميع العاثيات تقريبا تفضيلا لأنسجة LS على الأنسجة السليمة.

يتم الحصول على نتائج مماثلة عند مقارنة ارتباط العاثية ب LS بالخرف الجبهي الصدغي أو أنسجة FTD. أظهرت مقارنة ارتباط SCFV بأنسجة LS في كل من الأنسجة السليمة و FTD مرة أخرى ارتباطا انتقائيا بأنسجة LS في جميع المستنسخة تقريبا. تم استخدام المقايسة المناعية للبقع النقطية للتحقق بشكل أكبر من الارتباط بأنسجة LS وأيضا للتأكد من المستنسخة التفاعلية في التطبيقات المناعية الأخرى.

هنا ، يتم عرض استنساخ اثنين من الارتباط بنسيج LS. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق تحريك biop القائم على FM لعزل الكواشف ضد المرض ، والهدف المحدد للاهتمامات ، والكواشف ، والتي قد تكون بمثابة أدوات تشخيصية و / أو علاجية محتملة.