يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار ثلاث طرق مختلفة لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي تعتمد على المسبار وتستخدم لتحديد كمية الحمض النووي الريبي الصغير في عينات البلازما والمصل. يتم تحقيق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي القائم على المسبار عن طريق التحلل المائي والكشف عن المسبار الموسوم بالفلورسنت ، والذي يحتوي على مراسل فلورسنت ومروع. عندما يمتد البوليميراز من التمهيدي المنبع ويصل إلى الطرف الخمسة الأولي للمسبار ، فإنه يؤدي إلى تفكك مادي لباعث الفلورسنت عن التبريد.

بعد ذلك ، يتم إطلاق جزيء واحد من الفلورو أربعة ، والذي يتم تسجيله بواسطة الكاشف ويتم تقديمه كزيادة تدريجية في إشارة الفلورسنت من هذا التفاعل. في النهاية ، يمكن قياس كمية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المتولد بناء على الزيادة في التألق ، مما يسمح بقياس دقيق لتضخيم الهدف المضخم. تبرز هذه الطريقة كطريقة واعدة لاكتشاف المؤشرات الحيوية الجديدة لأنواع مختلفة من السرطانات وأمراض أخرى مثل مرض السكري.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على وفرة الحمض النووي الريبي الصغير في المصل والبلازما ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على عينات أخرى مثل الخلايا والأنسجة الطرفية. يعد العرض المرئي لهذا البروتوكول أمرا بالغ الأهمية حيث قد يكون من الصعب تعلم بعض الخطوات المتبعة في إغلاق شريحة مصفوفة السوائل النانوية بمجرد قراءة البروتوكول لاكتشاف الحمض النووي الريبي الصغير الناضج الكمي في الوقت الفعلي PCR في 4.2 ميكرولتر من مزيج كاشف QPCR الفردي لكل بئر من لوحة بئر بصرية 96 ، متبوعا ب 0.8 ميكرولتر من محلول تفاعل CDNA المناسب المحضر حديثا. أغلق اللوحة بالغطاء البصري المناسب ثم ابدأ QPCR على نظام PCR في الوقت الفعلي.

لإعداد بطاقة مصفوفة الموائع الدقيقة مع واحد إلى 1000 نانوجرام من إجمالي إدخال بدء الحمض النووي الريبي ، قم أولا بإذابة المخزن المؤقت لبادئات التجمع A و B ، وفوسفات نيوكليوتيدات الديوكسي ، وكلوريد المغنيسيوم ، ومثبط الحمض النووي الريبي على الجليد. ثم لإجراء النسخ العكسي ، قم بنقل 100 نانوجرام من كل عينة من الحمض النووي الريبي في أنبوب تجمع A أو تجمع B ، متبوعا بإضافة الحجم المناسب من الماء الخالي من النوكلياز ليصل الحجم الإجمالي في كل أنبوب إلى ثلاثة ميكرولترات. بعد ذلك ، قم بتجميع 4.5 ميكرولتر من كاشف النسخ العكسي المناسب في الأنابيب المقابلة المناسبة.

ثم ضع العينات في جهاز التدوير الحراري وابدأ النسخ العكسي. بينما يتقدم النسخ العكسي. بالنسبة لإجمالي مدخلات عينة الحمض النووي الريبي بين واحد و 350 نانوجرام ، قم بإذابة مجموعة محددة مسبقا من بادئات التضخيم المسبق على الجليد عندما تكون العينات جاهزة ، 22.5 ميكرولتر من كاشف المضخم المناسب.

امزج في أنابيب المسبح A والمسبح B وأضف 2.5 ميكرولتر من عينة CDNA المنسوخة عكسيا في كل منها. ثم قم بتحميل العينات في جهاز التحكم الحراري وابدأ دورة مكبر الصوت. في نهاية الدورة ، أضف 75 ميكرولترا من المخزن المؤقت 0.1 × tris EDTA إلى CDNA المضخم مسبقا لتحميل بطاقة الموائع الدقيقة.

بعد ذلك ، أضف 450 ميكرولترا من مزيج كاشف QPCR إلى تسعة ميكرولترات من CDNA المضخم المخفف PREPL للبطاقة A ، واستخدم المنتج المضخم PREPL المحضر باستخدام تجمع التمهيدي A وأضف 441 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى الحجم النهائي البالغ 900 ميكرولتر. ثم بمجرد وصولها إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة بطاقة المصفوفة منخفضة الكثافة من عبواتها وضعها على جانب رقائق معدنية لأسفل على منطقة نظيفة. أضف 100 ميكرولتر من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

امزج في كل من منافذ التعبئة الثمانية على البطاقة. قم بتدوير البطاقة لمدة دقيقة واحدة عند 331 GS ودرجة حرارة الغرفة. ثم بضربة بطيئة وثابتة وموحدة ، ادفع العربة عبر البطاقة حتى تصل إلى نقطة نهاية المادة المانعة للتسرب.

قم بإزالة بطاقة المصفوفة المختومة وقطع الخزانات. ثم تأكد من تثبيت الغطاء الساخن الصحيح للكتلة وحامل العينة في نظام PCR في الوقت الفعلي لمصفوفة الموائع الدقيقة. لتحميل المصفوفات السائلة النانوية ، قم بإذابة الكاشف المسبق المخفف ، وتضخيم CDNA وكاشف QPCR في الوقت الفعلي.

امزج واخلط زجاجة كاشف QPCR عن طريق الدوران. بعد ذلك ، أضف 22.5 ميكرولتر من مزيج كاشف QPCR إلى 22.5 ميكرولتر من CDNA المخفف والمضخم. ثم أضف خمسة ميكرولترات من كل عينة إلى ثمانية آبار من سير عمل مصفوفة السوائل النانوية 384 لوحة عينة البئر مع الحرص على وضع المسبح A والتجمع B لكل عينة.

في كتل الآبار الثماني المجاورة عندما يتم نقل جميع العينات ، قم بتغطية كل قسم من اللوحة بقطع من لوحة عينة المصفوفة المفتوحة. ثم قم بإذابة أول شريحة مصفوفة سوائل نانو إلى درجة حرارة الغرفة بعد حوالي 15 دقيقة. تم التأكيد على تثبيت غطاء تحرير الكتلة الصحيح وحامل العينة في نظام مصفوفة السوائل النانوية ، ثم قم بفك مكبس حقنة سائل الغاطس بسحب لطيف.

قم بإزالة الغطاء ، ضع الطرف في مكانه واغسل الهواء من الحافة. ثم ضع أطراف نظام التحميل داخل نظام التحميل. افتح الغطاء وضع لوحة العينة في نظام التحميل.

الآن ارتد زوجا من القفازات المناسبة. افتح عبوة الشرائح بعناية وقم بإرجاب الشريحة ببطء خارج العبوة دون لمس الجزء العلوي. ضع الشريحة في نظام التحميل مع الباركود على اليسار.

ثم قم بإزالة مانع التسرب من جزء لوحة العينة المخصص للتحميل ، واستخدم برنامج نظام التحميل لإدخال موضع شريحة الباركود المنزلق وموضع العينة وتكوين الطرف. أثناء تحميل الشريحة، قم بإزالة البلاستيك الشفاف والأحمر من أسفل غطاء الشريحة. ثم قم بإزالة الشريحة وإغلاقها بعناية في غضون 90 ثانية من نهاية عملية التحميل.

ضع الشريحة داخل مشبك اللوحة وغطاء المنزلق على الشريحة لمدة 30 ثانية للتأكد من وضع الغطاء بحيث يتم عرض الرمز الشريطي بشكل صحيح. ثم ضع حقنة سائل الغاطس داخل الشريحة بحيث يضغط الطرف على الغطاء واملأ الشريحة ببطء بسائل الغاطس مع الحرص على أن يمر السائل على طول الغطاء. بمجرد امتلاء الشريحة ، قم بإغلاقها بالقابس ، وأدر المسمار حتى ينكسر المقبض.

أخيرا ، قم بإزالة الغطاء البلاستيكي الموجود أعلى غطاء الشريحة وضع الشريحة بعناية في حامل الشرائح لنظام PCR في الوقت الفعلي. احرص على دعم الجزء السفلي من الشريحة أثناء خفضها دون لمس الجزء العلوي من الشريحة. ثم قم بتهيئة نظام PCR وابدأ برنامج PCR الكمي خلال ساعة واحدة من تحميل العينات.

باستخدام هذا الإجراء ، يمكن أن يؤدي حجم التفاعل البالغ خمسة ميكرولتر إلى نتائج مشابهة لتلك التي تم تحقيقها باستخدام حجم 20 ميكرولتر مع ارتباط قوي. ما يصل إلى 39 دورة هنا ، يتم عرض مخططات Altman والارتباط اللطيفة لجميع micro RN البالغ عددها 754 التي تم اختبارها على نفس العينة باستخدام بطاقات مصفوفة الموائع الدقيقة كما تم توضيح microRNAs التي تحتوي على قيم CT بين صفر و 19.99 في كلا المسارين تظهر أيضا تعبيرات متشابهة مع معامل تحديد 98٪ علاوة على ذلك ، يزداد عدد microRNAs مع اختلافات كبيرة لوحظت بين التجارب عند تحديد قيم التصوير المقطعي المحوسب بين 30 و 40. في هذا الرسم البياني ، يتم عرض بيانات منصة مصفوفة السوائل النانوية لجميع microRNAs البالغ عددها 754.

من المهم فحص منحنيات التضخيم للتأكد من أن النتائج تدل على التضخيم الحقيقي. يجب أيضا فحص microRNAs للتدبير المنزلي ، مثل U six ، بحثا عن التباين. على سبيل المثال ، في هذا الرسم البياني ، يتم عرض مجموعة نموذجية من U ستة مكررات تعرض انحرافا معياريا منخفضا تشير إلى موثوقية البيانات.

أخيرا ، توضح هذه البيانات التباين المتزايد ل U ستة مكررات في عينة ثانية. توفر التقنيات القائمة على المسبار عالية الإنتاجية مثل الموائع الدقيقة ومصفوفات سوائل نانا سهولة الكشف بشكل متكرر وفعال عن وفرة الحمض النووي الريبي الصغير المتعدد في عدد كبير من العينات في وقت قصير جدا. تم تصميم كل سير عمل لتلبية إنتاجية مختلفة بناء على عدد أهداف الحمض النووي الريبي الصغير وعدد العينات المراد تحليلها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء تقنيات PCR مختلفة في الوقت الفعلي القائمة على المسبار لتخصص وفرة NA الصغيرة.