التصوير كاليفورنيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل إشارات الكالسيوم المستحثة بمحفز ضوئي من المستقبلات الضوئية المخروطية في شبكية فأر باستخدام مستشعر حيوي فلوري. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الشبكية من سلالة فئران معدلة وراثياً تعبر عن مستشعر كالسيوم مشفر جينياً حصرياً في المستقبلات الضوئية المخروطية. وتتمثل الخطوة الثانية في قطع شرائح عمودية من نسيج الشبكية.

بعد ذلك، يتم تثبيت شرائح الشبكية على شرائح غطاء مجهرية ووضعها تحت مجهر فوتوني ثنائي. والخطوة النهائية هي تسجيل إشارات الكالسيوم من النهايات التشابكية الفردية للمستقبلات الضوئية المخروطية استجابةً للتحفيز الضوئي. وفي النهاية، يتم تحليل إشارات الكالسيوم المسجلة في مرحلة لاحقة.

باستخدام هذه الطريقة، يمكننا تسجيل نشاط العديد من مستقبلات التغذية في الذرة في آن واحد وبدقة دون خلوية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنةً بالتقنيات الموجودة، مثل التسجيلات الكهربائية للخلية الواحدة، في أنها أقل صعوبة وتستغرق وقتاً أقل. لذا، فإن السؤال الذي نود معالجته هو ما إذا كان الكالسيوم يشارك في تنكس المستقبلات الضوئية وكيفية حدوث ذلك.

تتيح لنا هذه الطريقة تحديد ما إذا كان تدفق الكالسيوم هو الذي يدفع تنكس المستقبلات الضوئية، أم أنه نتيجة لحقيقة أن الخلية تحتضر. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة أساساً لأن الحساسية الضوئية للشبكية يجب أن تظل محفوظة، وبالتالي يجب تنفيذ جميع الخطوات الدقيقة، بما في ذلك تشريح الشبكية وتقطيعها إلى شرائح، تحت ضوء أخضر أو أحمر. لبدء هذا الإجراء، انقل مقلة عين الفأر إلى طبق بتري يحتوي على محلول خارج خلوي مؤكسج حديثاً بالكربون.

قم بثقب مقلة العين عند أي نقطة على طول الحدود الفاصلة بين القرنية والصلبة باستخدام إبرة حقن حادة. بعد ذلك، ثبت العين من جهة الصلبة باستخدام ملقط وأدخل شفرة مقص واحدة بلطف في الثقب. قم بالقص على طول الحافة المسننة لفصل الجزء الأمامي من العين عن كأس العين.

بعد ذلك، اقطع كأس العين شعاعيًا عند موضع علامة القلم للإشارة إلى الموضع الظهري في الشبكية. ثم ضع كأس العين بحيث يتجه القطع الظهري بعيدًا. أمسك الصلبة من الجانبين الأيسر والأيمن لكأس العين عن طريق إدخال أطراف الملقط بين الشبكية والصلبة.

بعد ذلك، قم بفصل الشبكية عن طريق قلب الجزء الصلبي من الـ iica برفق. وأخيراً، اقطع العصب البصري لتحرير الشبكية من الصلبة. أمسك حافة الشبكية بملقط، وأزل الشوائب والجسم الزجاجي برفق من سطح الشبكية باستخدام ملقط ثانٍ.

عندما يكون سطح الشبكية نظيفاً، قم بإجراء ثلاثة شقوق شعاعية إضافية وأقصر. الآن، اغمر شريحة زجاجية ببطء في المحلول خارج الخلوي بالقرب من النسيج. اسحب الشبكية برفق فوق الشريحة الزجاجية بحيث يكون جانب الخلايا العقدية للأعلى، وذلك عن طريق الإمساك بالحافة لتقليل التلف الميكانيكي وطي النسيج.

بعد ذلك، قم بقص مستطيل يبلغ مقاسه حوالي 1 × 2 ملم من منطقة الشبكية المختارة باستخدام شفرة مشرط منحنية، وامسح المحلول الزائد من حول النسيج. ثم ضع غشاء ألياف النيتروسليلوز المُجهز مسبقاً فوق قطعة الشبكية، بحيث تلتصق جهة الخلايا العقدية بالغشاء. أضف فوراً قطرة من الوسط خارج الخلوي فوق الغشاء لتثبيت النسيج عليه بإحكام.

انقل نسيج الشبكية المثبت على الغشاء إلى غرفة التقطيع التي تحتوي على محلول خارج خلوي طازج. ثم قم بتقطيع الشبكية إلى شرائح عمودية بسمك 200 micrometer. وباستخدام قطاعة الأنسجة، قم بلصق شريحة واحدة مثبتة على الغشاء على غطاء شريحة زجاجي مُعد مسبقاً باستخدام شحم الفراغ العالي.

حافظ على نظافة السطح الزجاجي أسفل الشبكية وخلوه من الدهون. بعد ذلك، أضف قطرة من المحلول خارج الخلوي إلى كل شريحة مثبتة على غطاء شريحة في غرفة الحفظ في درجة حرارة الغرفة. أدخل الكاربوغين إلى الغرفة عن طريق فقاعه في خزان مياه صغير للحفاظ على رطوبة الغلاف الجوي في غرفة الحفظ.

اترك الشرائح لترتاح في غرفة الانتظار لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل نقلها واحدة تلو الأخرى إلى غرفة التسجيل. انقل شريحة من غرفة الانتظار إلى غرفة التسجيل وابدأ فوراً في ترويتها بمحلول خارج خلوي مكربن. حافظ على معدل تدفق تروية قدره 2 mL/min ودرجة حرارة تبلغ 37 °C.

في غرفة التسجيل. استخدم عدسة شيئية غمر مائي 20 x 0.95 NA وكاميرا CCD بالتزامن مع صمام ثنائي باعث للضوء (LED) بالأشعة تحت الحمراء أسفل غرفة التسجيل. ولتحديد موقع شريحة الشبكية، قم بتشغيل نظام التصوير ثنائي الفوتون وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة.

بعد ذلك، قم بتشغيل الليزر واضبطه على 860 nanometers. قم بتشغيل قناتي الكشف للتصوير الفلوري لـ ECFP وcitrine. بعد ذلك، وباستخدام برنامج الحصول على الصور، تحكم في مجهر الفوتونين لمسح واختيار صف من النهايات المخروطية للتسجيل، واضبط الحصول على الصور على صور بحجم 128 في 16 pixel أو تكوين مماثل، مع قصر المنطقة الممسوحة على النهايات المخروطية لتجنب تبييض الصبغات الضوئية في القطع الخارجية.

قم بتشغيل الليزر. اترك المخاريط تتكيف مع ليزر المسح وإضاءة خلفية التحفيز لمدة تتراوح من 20 إلى 30 ثانية قبل تقديم محفزات ضوئية أو تطبيق عوامل دوائية. ابدأ الآن بتقديم المحفزات العشوائية.

يتم توليد المحفزات عن طريق تعديل شدة الصمامين الثنائيين الباعثين للضوء (LEDs) بمرور الوقت، باستخدام لوحة معالج دقيق يتم التحكم فيها بواسطة برنامج مخصص. ثم ابدأ بتسجيل قناتي الفلورة في وقت واحد باستخدام برنامج الحصول على الصور المخصص لكل منهما. وقد ركزت التسجيلات على النهايات التشابكية للمستقبلات الضوئية المخروطية في شرائح الشبكية.

هذا مثال لمنطقة مسجلة تحتوي على سبعة أطراف فردية. تم تسجيل الفلورة باستخدام قناتين، إحداهما لـ fre scepter citrine، والأخرى لـ fret donor.ECFP. الموضح هنا هو التغيرات المستحثة بالضوء في فلورة citrine و ECFP المسجلة في منطقة اهتمام واحدة.

وفيما يلي استجابات الكالسيوم في نهاية مخروطية لسلسلة من ومضات الضوء الساطع مدتها ثانية واحدة على فترات زمنية مدتها خمس ثوانٍ. يوضح هذا الشكل التحليل الكمي النموذجي لاستجابات الكالسيوم في المخاريط الناتجة عن الضوء. وهنا تظهر استجابات الكالسيوم الناتجة عن الضوء من نهاية مخروطية واحدة.

يوضح هذا الشكل كيفية تحديد متوسط استجابة الكالسيوم. يمثل مستوى الكالسيوم في حالة الراحة الخط المرجعي قبل التحفيز الضوئي، وحجم الاستجابة هو ra، وهو المساحة الواقعة بين مستوى الكالسيوم في حالة الراحة وسعة الذروة، وبين حركية بدء الاستجابة وانتهائها. ويمكن توسيع هذا الإجراء بشكل أكبر.

على سبيل المثال، يمكن أن تكون إشارات الكالسيوم في المستقبلات الضوئية كبيرة تحت ظروف دوائية متنوعة وظروف تحفيزية قوية للبحث في أمور مثل التكيف أو دراسة الخطوات المختلفة للنقل الضوئي بالتفصيل. تتيح هذه التقنية استقصاء ديناميكيات الكالسيوم في المستقبلات الضوئية المخروطية تحت الظروف الفسيولوجية الطبيعية. وهذا أمر ذو صلة وثيقة بفهم التنكس الأولي والثانوي للمستقبلات الضوئية المخروطية في أمراض العمى البشرية مثل acro topia أو التهاب الشبكية الصباغي.