التصور

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح بروتوكول قابل للتكرار لتكوين آفات قلبية دقيقة ناتجة عن ESMO داخل قلوب الفئران المصابة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إصابة الفئران بـ ESMO والسماح بتطور تجرثم الدم، مما يمنح البكتيريا القدرة على الوصول إلى الأوعية الدموية القلبية حيث يمكنها غزو عضلة القلب وتكوين آفات مجهرية. بعد ذلك، يتم إما تضمين القلوب في البارافين وصبغها بالطريقة التقليدية، أو تثبيتها في مركب OCT لإجراء الصبغ المناعي الفلوري.

يمكن أن يُظهر تقييم المقاطع المصبوغة وجود آفات قلبية دقيقة موزعة عشوائياً عبر عضلة القلب، وترسبات كولاجين، ومقاطع من القلب في مرحلة النقاهة، ومحفظات عقدية داخل الآفة القلبية الدقيقة، مما يوضح الإجراء المتبع. هل أرماند براون طالب دراسات عليا في مختبري؟ ومع ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية حول التأثيرات الضارة بالقلب التي تسببها بكتيريا S pneumonia أثناء الإصابة بمرض المكورات الرئوية الغازي في الفئران.

يمكن تطبيق ذلك أيضاً على عينات قلبية من أنظمة أخرى مثل الرئيسيات غير البشرية أو البشر. ابدأ بزراعة سلالة ESMO Serotype four Tiger four في مرق Todd Hewitt حتى تصل الكثافة الضوئية إلى 0.5 عند 620 نانومتر. عند الوصول إلى الكثافة الصحيحة، قم بترسيب المزرعة عند 3,500 G لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي باستخدام خط تفريغ، وأعد تعليق البكتيريا باستخدام PBS معقم بتركيز 10,000 colony forming units per milliliter. الآن، قم بتخدير فئران valve C التي تتراوح أعمارها بين 10 و 12 أسبوعاً، وتحقق من حالة التخدير عن طريق قرص إصبع القدم برفق باستخدام ملقط غير مدبب، ثم املأ سرنجة بالمعلق البكتيري وثبت بها إبرة قياس 27 إلى 30 gauge. بعد ذلك، أمسك بالفأر المخدر من الرقبة بإحدى اليدين بينما تقوم بحقن 100 µL من المعلق داخل الصفاق باستخدام اليد الأخرى، ثم أعد كل فأر إلى قفصه.

عادةً ما تستيقظ الفئران بعد 30 إلى 40 ثانية من الحقن. ومن الضروري تحديد الجرعة الصحيحة من *S. pneumoniae* بدقة، وإلا فقد تتعافى الفئران من العدوى أو تصاب بمرض المكورات الرئوية الغازي بسرعة كبيرة تمنع تطور الآفات. وبما أن كل سلالة بكتيرية تختلف في مستويات virulence، فقد يتطلب تحديد الجرعة الصحيحة اتباع منهج التجربة والخطأ.

اترك العدوى تتقدم لمدة 24 ساعة على الأقل للوصول إلى مرحلة مبكرة، أو لمدة 30 ساعة للوصول إلى مرحلة عدوى متقدمة. بعد ذلك، يتم القتل الرحيم لكل فأر مصاب. أولاً، خذ عينة دم عن طريق تعقيم الذيل بمسحة كحولية وقص جزء يتراوح طوله بين مليمترين إلى ثلاثة مليمترات.

اجمع ميكرولترين من الدم من موقع القص. قم بتخفيف الدم تسلسلياً بمقدار عشر مرات في محلول PBS يحتوي على هيبارين الصوديوم بتركيز وحدة واحدة لكل milliliter. ازرع خمسة مستويات من التخفيفات على أطباق آغار دم الصويا ثلاثية التقسيم (triptych soy blood agar plates)، ثم حضنها طوال الليل.

في اليوم التالي، قم بإجراء تعداد المستعمرات. ثم ابدأ بحصد القلب كما هو موضح في القسم التالي. وبدلاً من ذلك، يمكن القيام بذلك بعد 30 ساعة من العدوى.

حاول إنقاذ الفأر عن طريق حقن الأمبيسيلين داخل الصفاق في 100 µL من المحلول الملحي. استمر في إعطاء الأمبيسيلين كل 12 ساعة لمدة 36 ساعة، ثم اجمع القلوب في النقاط الزمنية المحددة. أولاً، قم باستئصال القلب.

ثبّت الفأر الذي تم تخديره حتى الموت في وضعية الاستلقاء الظهري على منصة جراحية، ورش الصدر بـ 70%ethanol ثم جففه بالتربيت. باستخدام مقص جراحي وملقط، افتح تجويف الصدر. قم بإزالة القفص الصدري وقطع الحجاب الحاجز للكشف عن القلب والرئتين.

بعد ذلك، يتم قطع الأوعية الدموية المتصلة بالقلب واستخدام الملاقط لاستئصال القلب برفق دون التسبب في حدوث كدمات. يُشطف القلب باستخدام PBS ويوضع في كاسيت لجمع عينات الأنسجة بهدف إجراء تقطيع تاجي. ثم تُنقل الكاسيتات إلى محلول فورمالين منظم بتركيز 10%، وفي اليوم التالي، تُرسل لعملية الطمر في البارافين.

في المراحل المبكرة، يمكن التعرف على الآفات القلبية من خلال تغير مظهر لونها، وفي بعض الحالات من خلال وجود الخلايا المناعية. أما في الآفات المتقدمة، فتغيب الخلايا المناعية وتظهر بدلاً منها آفات كبيرة تشبه الأوعية الدموية (VA).

باستخدام مقاطع قلب بسمك 5 µm على شرائح زجاجية مشحونة إيجابياً، قم أولاً بتجميد المقاطع، ثم أذبها واتركها لتجف في الهواء. ثبت الشرائح في فورمالين منظم متعادل بتركيز 10% لمدة 10 دقائق عند 25 °C. بعد ذلك، أزل المثبت عبر ثلاث غسلات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

بعد ذلك، يتم نفاذ الأنسجة باستخدام 0.2%tritton X 100 في PBS لمدة 15 دقيقة. يتم إزالة المنظف عبر ثلاث غسلات إضافية بـ PBS النقي. ثم تُحجب الأنسجة باستخدام 10%coat serum في PBS لمدة ساعة، وبعد الشطف بـ PBS، يتم تغطية المقطع بمصل مضاد لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

عالج ضوابط التحكم السلبية باستخدام مصل أرنب خام. ونظرًا لأن أنسجة القلب تمتص صبغة XI المناعية الفلورية بسهولة، مما يؤدي إلى مستويات عالية من الخلفية، فمن المرجح أن يتطلب التركيز ووقت الحضن لأنواع مختلفة من الأجسام المضادة تحسينًا. بعد مرور ساعتين، اغسل المصل باستخدام PBS. ثم استبدل المحلول بجسم مضاد ثانوي واترك الشرائح تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الآن ضع DPI بتركيز 5 mg/mL واغسل الشرائح باستخدام PBS.

أخيراً، قم بتثبيت الشرائح في الوسط الرابط، ثم احفظها وصورها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy). ابدأ بإزالة البارافين وترطيب أقسام الأنسجة. استخدم غسولات الزيلين تليها سلسلة متدرجة من غسولات الكحول.

بعد ذلك، تُغمر المقاطع في حمض الفوسفوميتيك بتركيز 0.2% لمدة خمس دقائق، يتبع ذلك شطف بالماء لمدة خمس دقائق، ثم تُصبغ باستخدام صبغة سيريس ريد وحمض الريس بتركيز 0.1% لمدة ساعتين. ثم تُغسل المقاطع في حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.01 عياري لمدة ثلاث دقائق وتُشطف في ethanol بتركيز 70% لمدة دقيقة واحدة. الآن، يتم تجفيف المقاطع عن طريق عكس سلسلة حمامات الكحول المتدرجة، تليها غسلات بالزايلين، ثم تُثبّت الشرائح للفحص باستخدام المجهر الضوئي وتقييم النتائج.

أصيبت الفئران بمرض الرئة الرصاعي الغازي عقب تعريضها لسلالة Tiger 4. وقد لوحظ وجود آفات قلبية مجهرية في البطينين، كما سُجلت زيادة في حجم وعدد هذه الآفات بين 24 و30 ساعة بعد العدوى. وللتحقق من وجود بكتيريا S. pneumoniae بالفعل داخل الآفات، صُبغت المقاطع النسيجية للكشف عن عديد سكر الكبسولة من النمط المصلي 4 الذي تنتجه سلالة Tiger 4.

أكد هذا وجود تجمعات كثيفة ومترابطة داخل مواقع الآفات الدقيقة. تم إجراء صبغ بيرو سيريس ريد (Piro serious red) على مقاطع قلبية من فئران تم إنقاذها باستخدام الأمبيسيلين ومجموعات ضابطة غير مصابة. وفي حالات الإنقاذ.

حدثت زيادة كبيرة في وجود وكثافة الصبغة مع ظهور حزم تتدفق مما يبدو أنها مواقع آفات سابقة في البطينات. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إصابة الفئران بكمية كافية من S pneumonia للسماح للعدوى بالتقدم لمدة 28 إلى 30 ساعة على الأقل، وذلك لمنح تجرثم الدم والآفات القلبية الدقيقة وقتاً كافياً للتكون.