التصور العقدية الرئوية داخل القلب Microlesions وإعادة عرض القلب لاحقا

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار بروتوكول قابل للتكرار لتكوين آفة قلبية دقيقة ESMO داخل قلب الفئران المصابة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إصابة الفئران بالميسون والسماح بتطور تجرثم الدم ، وبالتالي منح البكتيريا إمكانية الوصول إلى الأوعية الدموية القلبية حيث يمكنها غزو عضلة القلب وتشكيل آفات مجهرية. ثم تكون القلوب إما بارافين ، مدمجة وملطخة تقليديا أو مثبتة في مركب OCT لتلوين الفلورسنت المناعي.

يمكن أن يظهر تقييم الأقسام الملطخة آفات قلبية دقيقة موزعة بشكل عشوائي عبر ترسب الكولاجين في عضلة القلب والنقاهة أقسام القلب وكبسولات المكورات الرئوية داخل الآفة الدقيقة القلبية مما يدل على الإجراء. هل أرماند براون طالب دراسات عليا في مختبري؟ على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للآثار الضارة للقلب للالتهاب الرئوي S أثناء مرض المكورات الرئوية الغازية في الفئران.

يمكن أيضا تطبيقه على عينات القلب من أنظمة أخرى مثل الرئيسيات غير البشرية أو البشر. ابدأ بنمو ESMO Serotype أربعة سلالة Tiger four في مرق Todd Hewitt إلى كثافة بصرية تبلغ 0.5 عند 620 نانومتر. عندما تكون في الكثافة الصحيحة بيليه المزرعة عند 3, 500 جم لمدة 10 دقائق.

ثم قم بإزالة المادة الطافية باستخدام خط فراغ وأعد تعليق البكتيريا باستخدام PBS معقم عند 10 ، 000 وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر. الآن تخدير الفئران C التي يبلغ عمرها 10 إلى 12 أسبوعا وتؤكد حالة التخدير مع قرصة إصبع القدم اللطيفة من زوج من الملقط الحاد ، وحقنة اللوتس مع التعليق البكتيري وإرفاق إبرة قياس 27 إلى 30. ثم أمسك بفأر مخدر من قفصه بيد واحدة أثناء حقن 100 ميكرولتر من التعليق داخل الصفاق باستخدام اليد الأخرى ، ضع كل فأر مرة أخرى في قفصه.

تستيقظ الفئران عادة بعد 30 إلى 40 ثانية من الحقن. يعد الحصول على جرعة الالتهاب الرئوي S الصحيحة أمرا بالغ الأهمية ، أو يمكن للفئران أن تتعافى من العدوى أو تصاب بمرض المكورات الرئوية الغازية بسرعة كبيرة جدا بحيث لا تتطور الآفات. نظرا لأن كل سلالة بكتيرية لها مستويات مختلفة من عدسات الأذن ، فقد يستغرق الأمر التجربة والخطأ لتحديد الجرعة الصحيحة.

اسمح للعدوى بالاستمرار لمدة 24 ساعة على الأقل إلى مرحلة مبكرة أو إلى 30 ساعة للعدوى في مرحلة متقدمة. في وقت لاحق القتل الرحيم لكل فأر مصاب. أولا ، خذ عينة دم ، وقم بتطهير الذيل بمسحة كحولية وقص قسما من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات.

اجمع ميكرولترين من الدم من موقع القصاصة. قم بتخفيف الدم بشكل متسلسل عشرة أضعاف في PBS الذي يحتوي على هيبارين الصوديوم بوحدة واحدة لكل مليلتر. ضع خمسة مستويات من التخفيفات على ألواح أجار دم الصويا ثلاثية الصويا ، واحتضنها طوال الليل.

في اليوم التالي خذ عدد المستعمرات. استمر في حصاد القلب كما هو موضح في القسم التالي. بدلا من ذلك ، بعد 30 ساعة من الإصابة.

حاول إنقاذ الفأر عن طريق إعطاء الأمبيسلين بين الصفاق في 100 ميكرولتر من المحلول الملحي. استمر في توفير الأمبيسلين كل 12 ساعة لمدة 36 ساعة وجمع القلوب في النقاط الزمنية المطلوبة. أولا ، حصاد القلب.

شل حركة الفأر القتل الرحيم في وضع ضعيف على منصة جراحية ، ورش الصدر بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركه حتى يجف. باستخدام المقص والملقط الجراحي ، افتح تجويف الصدر. قم بإزالة القفص الصدري وقم بتمرير الحجاب الحاجز لكشف القلب والرئتين.

ثم قم بقطع الأوعية الدموية المتصلة بالقلب واستخدم الملقط لاستئصال القلب برفق دون كدمات. اشطف القلب باستخدام PBS وضعه في كاسيت لجمع عينات الأنسجة لتقطيع الإكليل. ثم انقل الكاسيت إلى محلول الفورمالين المخزن المؤقت بنسبة 10٪ ، وفي اليوم التالي ، أرسل لتضمين البارافين.

في المراحل المبكرة ، يمكن التعرف على الآفات القلبية من خلال تغير لونها في مظهرها ، وفي بعض الحالات وجود خلايا مناعية. في الآفات المتقدمة ، ستكون الخلايا المناعية غائبة وكبيرة. تم العثور على آفات تشبه VA في مكانها.

باستخدام قسم قلبي بحجم خمسة ميكرون على شرائح زجاجية موجبة الشحنة ، قم أولا بتجميد الأقسام ، ثم قم بإذابتها واتركها تجف في الهواء. قم بإصلاح الشرائح في فورمين مخزن محايد بنسبة 10٪ لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. ثم قم بإزالة المثبت بثلاث غسلات و PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

يتبع ذلك نفاذية الأنسجة مع 0.2٪ tritton X 100 في PBS لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المنظف بثلاث غسلات أخرى في PBS مستقيم. ثم قم بسد الأنسجة بمصل طبقة بنسبة 10٪ في PBS لمدة ساعة بعد الشطف في PBS ، وقم بتغطية القسم بمصل مضاد لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

عالج الضوابط السلبية بمصل الأرانب الساذج نظرا لأن أنسجة القلب تمتص بسهولة صبغة XI المناعية الفلورية مما يؤدي إلى مستويات عالية من الخلفية ، فمن المحتمل أن يحتاج التركيز في وقت الحضانة لأنواع مختلفة من الأجسام المضادة إلى التحسين بعد ساعتين ، اغسل مصل مضادات الحساسية باستخدام PBS. ثم استبدل المحلول بجسم مضاد ثانوي واترك الشرائح تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الآن قم بتطبيق DPI بمعدل خمسة ملليغرام لكل ملليلتر واغسل الشرائح باستخدام PBS.

أخيرا ، قم بتركيب الشرائح في الأرض ، واحفظها وصورها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. ابدأ بإزالة البارافين وترطيب أقسام الأنسجة. استخدم غسول الزيلين متبوعا بسلسلة متدرجة من غسول الكحول.

ثم اغتسل الأقسام بحمض الفوسفو الميتيك 0.2٪ لمدة خمس دقائق ، متبوعا بشطف البقعة التالية بالماء لمدة خمس دقائق مع 0.1٪ حمض أحمر وخمض ريك خطير لمدة ساعتين. ثم اغسل الأقسام في 0.01 حمض الهيدروكلوريك العادي لمدة ثلاث دقائق واشطفها في 70٪ من الإيثانول لمدة دقيقة. الآن قم بتجفيف الأقسام عن طريق عكس سلسلة حمام الكحول المتدرج ، متبوعا بغسل الزيلين باستخدام تركيب الفحص المجهري الخفيف وتقييم الشرائح.

أصيبت الفئران بمرض المكورات الرئوية الغازية بعد تحد مع النمر. لوحظت أربع آفات قلبية دقيقة في البطينين ولوحظت زيادة في حجم الآفة وعددها بين 24 و 30 ساعة بعد الإصابة للتحقق من أن الالتهاب الرئوي كان بالفعل داخل الآفات. تم تلطيخ الأقسام للنمط المصلي أربعة عديد السكاريد المحفظي الذي أنتجه Tiger four.

أكد هذا وجود مجاميع كثيفة ومعبأة بإحكام داخل مواقع الآفات الدقيقة. تم إجراء تلطيخ بيرو الأحمر الخطير على أقسام القلب من الفئران التي تم إنقاذها بالأمبيسلين والضوابط غير المصابة. في عمليات الإنقاذ.

كانت هناك زيادة كبيرة في وجود وشدة البقعة مع تدفق العصابات مما يبدو أنه مواقع آفة سابقة في البطينين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إصابة الفئران بما يكفي من استخدام الالتهاب الرئوي S للسماح للعدوى بالاستمرار لمدة 28 إلى 30 ساعة على الأقل حتى يكون لتجرثم الدم والآفات الدقيقة القلبية الوقت الكافي لتكون.