ورم الابتدائي وMEF عزل الخلايا لدراسة الرئة الانبثاث

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة تكوّن أورام سرطان الثدي في الفئران. أولاً، يتم توضيح كيفية تحضير الخلايا الأولية من أورام الثدي لدى الفئران. بعد ذلك، يتم عرض كيفية استئصال رئة الفأر لتصوير النقائل الرئوية.

أخيرًا، يتم عرض تحضير الخلايا الليفية الجنينية للفئران من أجنة الفئران في النهاية، حيث توضح هذه الطرق أنه يمكن استخدام الفئران المعدلة وراثياً لـ mouse mammary tumor virus polyoma middle T antigen لدراسة تكوين أورام سرطان الثدي. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول سرطان الثدي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في دراسة الأورام الصلبة الأخرى. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، نظراً لأهمية عزل الأورام فقط دون غيرها من الأنسجة أثناء خطوات استئصال الورم. ابدأ باستخدام المقص لفتح الجلد من فتحة الإحليل إلى الرقبة في فأر معدل وراثياً لـ mouse mammary tumor virus polyoma middle T antigen.

بعد ذلك، قم بتثبيت الجلد وعزل ورم الثدي. اغسل الورم في موضعه باستخدام PBS بارد وضع الورم في طبق زراعة أنسجة معقم بقطر 10 سنتيمتر. بعد ذلك، انقل الطبق إلى غطاء تدفق رقائقي معقم واستخدم شفرة حلاقة ومقصاً معقمين لتقطيع الورم إلى قطع بحجم واحد مليمتر مكعب.

يتم تحضين القطع مع collagenase على هزاز دوراني عند 37 درجة مئوية. وبعد مرور ساعتين، يتم تدوير معلق أنسجة الورم الناتج في جهاز الطرد المركزي لترسيب المكونات. تُغسل الراسبة ثلاث مرات إضافية في PBS Resus، ثم يتم تعليق الراسبة في 2 mL من tripsin EDTA بعد الغسلة الأخيرة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية مع التحريك.

بعد ذلك، اغسل الخلايا ثلاث مرات أخرى وأعد تعليقها في وسط نمو عادي. وأخيرًا، قم بتحضين الخلايا في طبق زرع أنسجة بقطر 10 سنتيمتر، مع تغيير الوسط يوميًا على مدار الأيام الثلاثة التالية حتى يتم الحصول على عدد الخلايا المطلوب. وقبل استئصال الرئة، قم بإزالة الكبد والحجاب الحاجز وإزاحة الأضلاع.

ثم افتح الجزء العلوي من الرغامي، بالقرب من الوريد الوداجي، واستخدم قسطرة لحقن العامل المناسب عبر الرغامي لملء الرئتين، ثم استخرج الرئتين، وفي حال استخدام Z fix، قم بتضمين النسيج في البارافين. أما في حال استخدام حبر الهند، فانقع النسيج في محلول inec لمدة خمس دقائق؛ حيث سيظهر نسيج الرئة الطبيعي باللون الأسود بينما ستظهر العقد الورمية باللون الأبيض. صنف أي عقد ورمية مرئية في المواقع الثانوية والتي يبلغ قطرها 0.5 millimeters أو أكثر على أنها نقيلات لتوليد أرومات ليفية جنينية للفئران.

أولاً، افتح جلد فأرة حامل من فتحة الإحليل إلى الرقبة كما تم توضيحه للتو، مع الحرص على عدم إزعاج الأجنة. بعد ذلك، قم بإزالة قرني الرحم وشطفهما بمحلول PBS معقم. ثم افصل الأجنة بعناية عن المشيمة، واحداً تلو الآخر.

ضع كل جنين في طبق زراعة بقطر 10 سنتيمتر يحتوي على PBS بارد جداً. بعد إزالة الرأس والكبد والأمعاء، اشطف الجزء المتبقي من الجنين في إحدى آبار طبق زراعة أنسجة مكون من 12 بئر يحتوي على PBS، ثم قطع الجسم إلى قطع بحجم 1 مليمتر مكعب. انقل القطع إلى بئر آخر يحتوي على 5 مليلتر من tripsin EDTA واحضن النسيج عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

بعد مرور خمس دقائق، أضف 1 mL من FBS لإيقاف عملية الهضم. بعد ذلك، قم بطرد خلية تعليق الخلايا الناتجة مركزياً ثم أعد تعليق الراسب. في 1 mL من DMEM الدافئ، انقل الخلايا أخيراً إلى طبق زراعة بقطر 10 cm يحتوي على 10 mL من DMEM المدعم بالمضادات الحيوية، وازرع الخلايا حتى الوصول إلى عدد الخلايا المطلوب.

تعتمد مرحلة تطور الورم التي يتم عندها التضحية بالحيوان على الدراسة المحددة وإرشادات لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات (I-A-C-U-C). على سبيل المثال، تم التضحية بفأر FVB يبلغ من العمر 100 يوم، حامل لمستضد T المتوسط من بوليوميا فيروس أورام الثدي لدى الفئران، بعد ثلاثة أشهر من عزل ورم في ثدي الفأر كما تم توضيحه للتو. وقد تم الحصول على خلايا الورم الأولية.

نظراً لأن العديد من الجينات تتوسط عملية انتقال سرطان الثدي إلى الرئتين، فقد تم استئصال الرئتين أيضاً كما تم توضيحه للتو لدراسة العملية النقيلية. بعد ذلك، تم نفخ الرئتين بمادة Z fix وصبغها بحبر الهند (India ink) لتصور العقد الورمية. تظهر هنا أرومات ليفية جنينية للفئران، معزولة من أجنة فئران من سلالة FVB.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الورمية الأولية للفأر والأرومات الليفية الجنينية للفأر، وكيفية استخراج رئة الفأر. لا تنسَ أن العمل باستخدام ISO fluorine يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل العمل داخل خزانة استخلاص كيميائية (chemical F hood) أثناء تنفيذ هذا الإجراء.