تحليل الوراثية المحسنة من واحدة Bioparticles الإنسان المستردة من قبل المجهرية المبسطة من الطب الشرعي الأدلة "تاتش DNA"

الهدف العام من هذا الإجراء هو استعادة الخلايا الفردية أو المتكتلة التي تسمى الجسيمات الحيوية المفترضة من أدلة الحمض النووي التي تعمل باللمس الشرعي والحصول على ملف تعريف الحمض النووي للمتبرع. أثناء ارتكاب جريمة عنيفة، يتم نقل عدد صغير من الزنازين من فرد إلى شخص آخر، كما هو الحال عندما يمسك المعتدي بمعصم الضحية. من أجل استعادة العدد الصغير من الخلايا أولا ، استخدم طبقة هلامية منخفضة الالتصاق متصلة بشريحة مجهرية لأخذ عينات من منطقة التلامس.

الخطوة الثانية هي تلطيخ الجسيمات الحيوية المنقولة لتسهيل المشاهدة تحت المجهر. بعد ذلك ، قم بعزل الجسيمات الحيوية من فيلم الهلام باستخدام التلاعب الدقيق. اجمع المادة اللاصقة القابلة للذوبان في الماء عند طرف إبرة التنغستن واستخدمها لإزالة الجسيمات الحيوية ذات الأهمية من سطح فيلم الجل.

تتمثل الخطوة الأخيرة في نقل الجسيمات الحيوية التي تم جمعها بشكل فردي بعناية إلى مزيج تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الجزء السفلي من مجموعة تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستخدام طرق كتابة الحمض النووي المحسنة في نهاية المطاف للحصول على ملف تعريف الحمض النووي للمتبرع بأدلة الحمض النووي النزرة. حسنا، في مختبري، نركز على التحليل الجيني للأعداد الصغيرة من الخلايا التي يتم نقلها أثناء ارتكاب جريمة عنيفة ضد الشخص بين فرد وفرد آخر، أو بين فرد وكائن. غالبا ما تفشل الطرق التقليدية في استعادة ملف تعريف الحمض النووي من هذه الأعداد الصغيرة من الخلايا.

لقد طورنا هنا طريقة مبسطة للتعافي المادي والتحليل الجيني لمثل هذه الأعداد الصغيرة من الخلايا ، سواء كانت خلايا فردية أو تكتلات من الخلايا التي يمكن دمجها في أي مختبر للطب الشرعي. ستظهر الإجراء كاتي فيريش ، طالبة الدراسات العليا في مختبري. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد فيلم الجل الذي سيتم استخدامه لجمع الجسيمات الحيوية.

قم بقص فيلم الجل بالحجم المطلوب المناسب لشريحة المجهر الزجاجي المستخدمة كدعم صلب. على سبيل المثال ، بالنسبة للشريحة الزجاجية بحجم ثلاث بوصات × بوصة واحدة ، استخدم حجم فيلم الجل بوصتين × 0.75 بوصة. قم بإزالة الدعامة البيضاء من فيلم الجل وقم بتوصيل فيلم الجل بشريحة المجهر ، واضغط لأسفل بقوة لضمان التثبيت الكامل.

لاحظ أن هناك طبقة واقية علوية شفافة لا ينبغي إزالتها للسماح بالضغط على طول قطعة فيلم الجل دون تلويث سطح فيلم الهلام ، ويمكن تخزين شرائح فيلم الهلام المحضرة مع الطبقة الواقية المرفقة في درجة حرارة الغرفة لحين الحاجة. عندما تكون جاهزا لاستخدام فيلم الجل ، استخدم ملاقط معقمة لإزالة الطبقة الواقية العلوية الشفافة. ضع سطح فيلم الجل على اتصال مباشر بجسم أو سطح مطلوب.

على سبيل المثال ، جلد الإنسان من الرسغ. استخدم قدرا صغيرا من الضغط لضمان النقل الفعال للجزيئات الحيوية إلى فيلم الجل. لا تضغط كثيرا لأن الشريحة الزجاجية يمكن أن تكسر عينات متعددة من نفس الكائن أو يمكن جمع السطح على نفس القطعة من فيلم الجل بنفس الطريقة ، يمكن جمع الجسيمات الحيوية من الأشياء والملابس مثل طوق القميص.

لتأكيد نقل الجسيمات الحيوية إلى فيلم الهلام، افحص الشريحة على مجهر استريو باستخدام إضاءة عبر أو epi. التكبير بحوالي 20 × هو الأفضل لعرض مساحات أكبر من فيلم الهلام، في حين أن التكبير بحوالي 200 × هو الأفضل لعرض الجسيمات الحيوية الفردية. قم بتخزين شريحة عينة فيلم الجل في درجة حرارة الغرفة في صندوق منزلق مغطى.

حتى تصبح جاهزة للتلوين و / أو جمع الجسيمات الحيوية ، يمكن تلطيخ الجسيمات الحيوية للمساعدة في التصور. لتحقيق هذا المكان الأول ، تم إعداد شريحة عينة فيلم الهلام كما هو موضح سابقا على رف تلطيخ منزلق فوق الحوض. باستخدام ماصة نقل يمكن التخلص منها ، قم بتغطية سطح فيلم الجل بالكامل ببقعة زرقاء ثلاثية الأبعاد في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة إلى دقيقتين.

قم بإزالة البقعة الزائدة عن طريق إمالة الشريحة للسماح للبقعة بالتصريف في الحوض إذا لزم الأمر. يمكن شطف الشريحة عن طريق الفيضانات اللطيفة بالماء المعقم باستخدام ماصة نقل يمكن التخلص منها. بعد تجفيف الشريحة ، اعرض الشريحة باستخدام مجهر استريو لضمان التلوين المناسب.

يمكن تخزين الشريحة الملطخة في درجة حرارة الغرفة في صندوق منزلق مغطى. ابدأ هذا الإجراء بوضع العدد المناسب من أنابيب PCR سعة 0.2 ملليلتر في رف ووضع العلامات على الأنابيب بشكل مناسب. قم بإعداد حجم مناسب من مزيج تضخيم STR للعدد المطلوب من العينات.

تمتزج الدوامة والرئيسية جيدا ولفترة وجيزة جهاز طرد مركزي في مسار PI صغير للطرد المركزي. 3.5 ميكرولتر من التضخيم. امزج كل أنبوب في كل غطاء أنبوب 0.2 ملليلتر بشكل فضفاض.

ضع قطعة من الشريط اللاصق على الوجهين مباشرة على كتلة زجاجية. سيتم استخدام هذا لتثبيت أنبوب 0.2 مليلتر في مكانه أثناء جمع العينات. ضع قطعة أخرى من الشريط اللاصق على الوجهين على شريحة مجهر زجاجي نظيف.

ثم ضع قطعة من شريط الكتف الموجي القابل للذوبان في الماء فوق الشريط اللاصق على الوجهين. قم بتثبيت الشريط في موضعه عن طريق الضغط على طول الشريط. يمكن بعد ذلك إزالة الطبقة البيضاء العلوية الواقية.

بعد ذلك ، ضع أول أنبوب 0.2 مليلتر على الشريط اللاصق على الوجهين على الكتلة الزجاجية. ضع هذا الأنبوب جانبا حتى يتم جمع العينة. ضع شريحة شريط الجندي الموجي القابل للذوبان في الماء تحت المجهر أثناء العرض بتكبير منخفض.

استخدم طرف إبرة حامل الألسنة لكشط سطح الشريط برفق من أجل جمع الكمية الصغيرة أو كرة المادة اللاصقة في نهاية الإبرة. يعتمد حجم كرة المادة اللاصقة على عدد الجسيمات الحيوية التي سيتم جمعها بعناية. انزع الألسنة.

قف إبرة مع لاصق من تحت المجهر دون إزعاج طرف الإبرة. ضع الإبرة في الرف إذا لزم الأمر. الجانب الأكثر أهمية في الإجراء هو جمع ونقل الجسيمات الحيوية.

لضمان النجاح ، يجب ممارسة التقنيات حتى يتقن المحلل فيها. ضع عينة من فيلم الهلام المعدة مسبقا على مرحلة المجهر باستخدام كتلة زجاجية لدعم الشريحة. اضبط التركيز والتكبير حتى يمكن عرض الجسيمات الحيوية بسهولة.

حدد الجسيمات الحيوية التي سيتم جمعها. استرجع إبرة التنغستن بالكرة اللاصقة وضع الإبرة فوق سطح فيلم الجل حيث توجد الجسيمات الحيوية ذات الأهمية. اضغط على طرف الإبرة لأسفل بحيث تكون على اتصال بالجسيم الحيوي.

ارفع الإبرة لأعلى للتأكد من جمع الجسيمات الحيوية. كرر هذه العملية حتى يتم جمع العدد المطلوب من الجسيمات الحيوية. ضع أنبوب PCR معد 0.2 مل على مرحلة المجهر.

اضبط التكبير بحيث يكون الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على مزيج التضخيم في بؤرة التركيز. أثناء المشاهدة من خلال المجهر ، أدخل إبرة التنغستن بعناية في أنبوب PCR سعة 0.2 مليلتر حتى يصبح طرف الإبرة في مزيج التضخيم. أمسك الإبرة في مزيج التضخيم حتى تذوب المادة اللاصقة ويلاحظ إطلاق الجسيمات الحيوية في المحلول.

إزالة الإبرة. ضع الأنبوب 0.2 ملليلتر في وضع مستقيم وقم بتغطيته بشكل غير محكم. نظف إبرة التنغستن بمنديل كحولي مبلل مسبقا وكرر إجراء التجميع هذا للحصول على عينات إضافية.

لبدء بروتوكول التضخيم المعزز للتنميط الصبغي STR للجسيمات الحيوية المجمعة ، أضف 1.5 ميكرولتر من محلول التحلل إلى كل أنبوب 0.2 مليلتر يحتوي على مزيج تضخيم وتغلق الجسيمات الحيوية أغطية الأنابيب بإحكام. ضع العينات في جهاز التدوير الحراري وقم بتضخيم العينات باستخدام ظروف التدوير الموضحة في نص البروتوكول عند اكتمال التضخيم. قم بتخزين منتجات التضخيم على أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للكشف عن طريق الرحلان الكهربائي الشعري.

لا يتم عرض صور تمثيلية للجزيئات الحيوية الفردية في عينة طوق القميص. الجسيمات الحيوية التي تم جمعها محاطة بدائرة. تشير الدوائر الحمراء إلى أنه تم استرداد ملف تعريفي.

يتم تضمين النسبة المئوية لاستعادة الأليل. تشير الدوائر السوداء إلى أنه لم يتم استرداد الملف الشخصي. وبالمثل ، فإن هذه الصور عبارة عن جزيئات حيوية متكتلة في عينة طوق القميص الموضحة هنا هي ملف تعريف STR الذي تم الحصول عليه من إحدى عينات الجسيمات الحيوية الفردية من طوق القميص.

تم تحديد دقته بالمقارنة مع ملف تعريف مرجعي. يتم تعيين أرقام الأليل أسفل كل ذروة في كل موضع. يمثل المحور x حجم الجزء، ويمثل المحور Y شدة الإشارة.

هذا المظهر الجانبي ذو جودة عالية مع ارتفاعات ذروة متوازنة بشكل معقول بين الموضع ولا يوجد تسرب أليلي. هذا الملف الشخصي التالي هو ملف تعريف STR كامل تم الحصول عليه من إحدى عينات الجسيمات الحيوية المتكتلة من طوق القميص. أخيرا ، يوضح هذا الشكل مثالا على التنميط غير الناجح للحمض النووي لجسيم حيوي واحد مع استعادة أليل بنسبة 3٪.

يجب أن تعزز هذه الطريقة استعادة ملامح الحمض النووي أحادية المصدر من المهاجمين في حالات الاعتداء الجسدي. لم يفلت من انتباهنا أن هذه الطريقة تزيل أيضا بعض المشكلات المرتبطة بتفسير وتفكيك ملفات تعريف الحمض النووي المختلطة.