العدوى البكتيرية النظامية والمناعة الظواهر الدفاع في

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيل عدوى بكتيرية قوية وقابلة للتكرار إلى ذبابة الفاكهة ، ميلانوجاستر ، ثم قياس شدة العدوى لاحقا وتحديد الاستجابة المناعية للمضيف. يتم تحقيق ذلك عن طريق توصيل العدوى البكتيرية أولا إلى الذباب باستخدام حاقن نانو. يمكن تتبع ما بعد الوفيات بعد الإصابة بمرور الوقت ، ويمكن تحديد الحمل البكتيري الجهازي في أي وقت عن طريق تجانس الذباب المصاب وقياس عدد البكتيريا الموجودة.

يمكن أيضا قياس الدفاع المناعي للمضيف عن طريق قياس مستوى التعبير عن جينات الببتيد المضادة للبكتيريا ، وفي النهاية القياس الكمي وتوصيف العدوى البكتيرية. في ذبابة الفاكهة ، يمكن استخدام ميلانوجستر لاختبار كيف تغير العوامل الوراثية والبيئية الكفاءة المناعية للذبابة. يمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة الأسئلة الرئيسية في مجال مناعة الحشرات ، مثل كيفية تأثير العوامل الوراثية والبيئية المضيفة على القدرة المناعية أو كيف تختلف البكتيريا المميزة في حركية العدوى ، على الرغم من أننا نستخدم هذه الطريقة لقياس الدفاع المناعي لذبابة الفاكهة السوداء ضد العدوى البكتيرية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الحشرات الأخرى ويمكن الاستفادة من أنواع أخرى من مسببات الأمراض مثل الفيروسات أو الفطريات.

من المشكلات الشائعة التي يواجهها الناس عندما يتعلمون هذه الطريقة لأول مرة أنها قد تسبب الكثير من الإصابات للذباب ، مما قد يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات بشكل مفرط ، حتى في الضوابط. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لتعلم كيفية الإصابة بالعدوى بأقل ضرر للذبابة. نظرا لأن الأنواع المضيفة لدينا oph melanogaster صغيرة جدا ، يجب أن تتم العدوى تحت المجهر ، مما يزيد من التعقيد الأولي للتقنية.

ومع ذلك ، نعتقد أن عرضا صغيرا لهذه التقنية سيجعلها في متناول العلماء الذين لديهم خبرة محدودة فقط مع الذباب. لبدء التجربة ، حدد مستعمرة واحدة من لوحة رئيسية معدة مسبقا وقم بتلقيح قارورة من الوسط المعقم. تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية إلى المرحلة الثابتة.

بمجرد أن تصل الثقافة إلى المرحلة الثابتة ، قم بتكسير الخلايا برفق من 600 ميكرولتر من المزرعة في جهاز طرد مركزي منضدي لمدة ثلاث دقائق عند 5 ، 000 مرة. G ، ثم تخلص من رينا والريسوس. البكتيريا في 1000 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المعقم أو PBS.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الخلايا المعلقة في PBS المعقم لتحقيق الامتصاص المطلوب 600 نانومتر واستخدم هذا التعليق لإصابة الذباب. قم بإعداد إبرة زجاجية عن طريق سحب شعرية زجاجية من السيليكات واستخدم الملقط لقطع طرف الإبرة لإنشاء فتحة قطرها 50 ميكرومتر. بعد ذلك ، ضع حلقة السقف O والفاصل الأبيض مع توجيه الغمازة الكبيرة للخارج على المكبس المعدني للحاقن.

املأ الإبرة الزجاجية بالزيت المعدني باستخدام حقنة بإبرة قياس 30. ثم ضع الإبرة الزجاجية المملوءة من خلال الكوليت وضع الحلقة O الأكبر حول قاعدتها على بعد ملليمتر واحد من الطرف الحاد للإبرة. حرك الإبرة على المكبس المعدني وقم بلف الطمة برفق حتى تصبح آمنة.

تبديد الزيت المعدني من الحاقن ، وترك كمية صغيرة من الزيت في الإبرة لتكون بمثابة حاجز بين الحاقن والتعليق البكتيري. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل الزيت المعدني أو المعلق البكتيري أو بين السائلين. ثم اضبط الحاقن على الحجم المطلوب للحقن.

أدخل بعناية طرف الإبرة الشعرية في أنبوب من PBS المعقم واضغط على زر التعبئة الموجود على الحاقن لملء إبرة الحاقن لتوليد أدوات التحكم في الجرح. حقن الذباب المخدر ب PBS معقم في البطن الأمامي على السطح الجانبي البطني ، ضع الذباب المحقون في قوارير جديدة بوسائط جديدة وضع القوارير على جانبها لمنع الذباب من الالتصاق بالطعام قبل أن يتعافى من التخدير. بعد ذلك ، قم بإخراج الوسائط المعقمة المتبقية من الحاقن وأعد ملء نفس الإبرة بالتعليق البكتيري.

كرر الإجراء وحقن الذباب بالتعليق البكتيري. بدلا من ذلك ، يمكن توصيل العدوى عن طريق وخز دبوس الإنتان. لتحضير الدبوس المعدي ، قم بإذابة نهاية طرف ماصة صغيرة سعة 200 ميكرولتر وأدخل دبوس منوشين حشرة 0.15 ملم في البلاستيك المصهور.

اسمح للبلاستيك بالتصلب بحيث يتم تثبيت الدبوس في مكانه مع 0.5 سم من الدبوس الممتد من ذباب التخدير البلاستيكي بثاني أكسيد الكربون وخز الذباب في الصفيحة الجنبية القصية للصدر بالإبرة ، وتجنب مواقع التعلق بالأجنحة والساقين. قم بإزالة الذباب من دبوس التفاصيل باستخدام ملقط ناعم. تأكد من غمس الدبوس في التعليق البكتيري بين وخز كل ذبابة.

ضع الذباب المثقوب في قارورة جديدة مع وسط ذبابة جديد وضع القارورة على جانبها حتى يتعافى كل الذباب من التخدير. ضع مجموعة فرعية من الذباب المصاب في أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية على الجليد. أضف 250 ميكرولترا من PBS إلى كل أنبوب واستخدم مدقة لتجانس الذباب.

اللوحة التالية ، التجانس على LB تهوية باستخدام لوحة حلزونية. بدلا من ذلك ، قم بلوحة التجانس عن طريق التخفيف التسلسلي. انقل كل ذبابة متجانسة إلى الصف الأول من 96.

صفيحة البئر واملأ كل بئر من الصفوف المتبقية ب 90 ميكرولترا من PBS باستخدام ماصة متعددة القنوات. خذ 10 ميكرولتر من الصف الأول الذي يحتوي على تجانس الذباب وقم بتوزيع الجانس في الصف الثاني. قم بتثبيته لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل لخلط التجانس جيدا.

ثم خذ 10 ميكرولترات من المتجانس وانقله إلى الصف التالي. كرر هذا الإجراء باستخدام الصفوف المتبقية بدءا من الصف السفلي. استخدم الماصة متعددة القنوات لأخذ 10 ميكرولتر من كل بئر وإيداعها على لوح LB.

تأكد من توزيع العينات كنقاط منفصلة لا تلامس بعضها البعض. كرر هذه الخطوة حتى يتم أخذ عينات من جميع الآبار من كل صف ، مع الاستغناء عنها بترتيب تنازلي للتخفيف على لوحة LB. أيا كانت طريقة الطلاء المستخدمة ، احرص على عدم زيادة نمو الألواح حتى تظل المستعمرات صغيرة وسرية

أخرج الطبق من الحاضنة. بمجرد أن تنمو البكتيريا التجريبية مستعمرات مرئية ، ولكن قبل مستعمرات ذبابة الفاكهة ، تصبح ميكروبات الأمعاء مرئية بعد حوالي 24 ساعة للصفائح الحلزونية. عد المستعمرات التي تنمو باستخدام عداد مستعمرات آلي يمكنه تقدير الحمل البكتيري لكل مليلتر من التجانس بناء على عدد وموضع المستعمرات على اللوحة.

بالنسبة للألواح الموضعية ، قم بحساب المستعمرات يدويا لكل ذبابة من أي تخفيف يحتوي على 30 إلى 300 مستعمرة واحسب عدد البكتيريا لكل مليلتر من التجانس الأصلي. تم حقن الذباب ب 50 نانولترا من المعلقات البكتيرية التي تغطي مجموعة من الكثافة البصرية وتختلف جرعة العدوى المتجانسة والمغلفة على الفور باختلاف الكثافة البصرية للتعليق البكتيري المستخدم في الحقن. ترتبط الأحمال البكتيرية الأولية ارتباطا وثيقا بحقن OD الأولي.

يتيح هذا البروتوكول مراقبة أنواع مختلفة من العدوى. أصيب الذباب ب Providncia rei ، والتي يمكن أن تسبب عدوى مزمنة شبه مميتة تستمر لمدة 20 يوما أو أكثر. الذباب المصاب بالقولون سيتخلص من العدوى في غضون ست ساعات. ما بعد العدوى.

يمكن تقدير تحريض الجهاز المناعي من خلال عزل الحمض النووي الريبي ولاحق Q rtpcr R لنسخة الببتيد المضادة للبكتيريا بشكل مماثل ، ولكن أقل كمية الذباب التي تعبر عن GFP تحت سيطرة الببتيد المضاد للميكروبات. يمكن استخدام محفزات الجينات لتصور تحريض الجهاز المناعي بمجرد إتقانها. يمكن أن تسمح هذه التقنية بإصابة مئات الذباب في الساعة.

يمكن تصور أي عدد من الأنماط الظاهرية في الذباب بعد إصابته بالعدوى ، بما في ذلك القدرة على التعلم ، أو حالة التمثيل الغذائي ، أو أي سمة أخرى يمكن تخيلها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيل عدوى بكتيرية قوية وقابلة للتكرار إلى ذبابة الفاكهة ، وسرطان الجلد ، وكيفية قياس شدة العدوى لاحقا وتحديد الاستجابة المناعية للمضيف. لا تنس أن بعض البكتيريا يمكن أن تؤثر على صحة الإنسان.

تأكد من اتباع إجراءات السلامة البيولوجية المناسبة واتخاذ تدابير احتواء كافية لمنع الذباب المصاب من الهروب. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.